楊 平，陳 博，賈貴清，伍曉汀，張祥運，李 衛(wèi)

(1.四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)胃腸外科，成都 610110；2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科，合肥 246400；3.四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院胃腸外科，成都 610072；4.四川大學華西臨床醫(yī)學院/華西醫(yī)院胃腸外科，成都 610041)

胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)起源于胃腸道卡哈爾間質細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)，是胃腸道最常見的間充質源性腫瘤，每年發(fā)病率為10～20/100萬人[1-3]。雖然GIST的甲磺酸伊馬替尼分子靶向治療效果較好，但仍然有10%～20%GIST的患者會出現(xiàn)原發(fā)耐藥及40%～50%發(fā)生繼發(fā)耐藥[4]，且治療期間繼發(fā)耐藥每年遞增10%,但GIST的耐藥機制不明。近年來在急性骨髓性白血病研究發(fā)現(xiàn)c-CBL是一種新型泛素連接酶E3，可以負調節(jié)受體酪氨酸激酶(RTK)；突變的c-CBL能夠激活其他RTK(如c-Kit)[5-6]。這些成果對探索有效逆轉甲磺酸伊馬替尼耐藥的胃腸道間質瘤有較重要的參考意義。因此，本研究將正常c-CBL基因導入GIST耐藥細胞，觀察在體外甲磺酸伊馬替尼對耐藥細胞生長影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料 瘤源細胞來自1例29歲青年男性患者，診斷為小腸間質瘤復發(fā)伴腹腔轉移。腹腔瘤體出現(xiàn)體積增大，有再次手術指征。

1.1.2主要試劑 中性蛋白酶(Dispase)購于美國GIBCO公司，胎牛血清(FBS)購于美國GBICO公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購于杭州吉諾生物醫(yī)藥公司，C-kit抗體購于美國Snata Curzt公司，c-CBL抗體購于美國BD公司，甲磺酸伊馬替尼(格列衛(wèi)，Glivec) 購于瑞士Novatis公司，攜帶正常c-CbL基因的反轉錄病毒載體購于中國大連寶生物工程有限公司。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(德國Heareus公司)，倒置顯微鏡(日本Olmypus公司)，超凈工作臺(德國Hearues公司)，低溫高速離心機(德國Heraeus公司)，四唑鹽比色法(MTT)酶標儀(美國Bio-TEK)。

1.2方法

1.2.1GIST原代細胞的獲取、分離和培養(yǎng) 選擇經手術切除后腹腔內復發(fā)的GIST患者(口服甲磺酸伊馬替尼)超過6個月(400 mg/d),影像學證實腹腔瘤體復發(fā))，有手術指征。手術切除的新鮮GIST組織經快速病理證實為梭型細胞腫瘤，將腫瘤剔除壞死及污染組織，PBS沖洗3次，再用含500 μg/mL慶大霉素、500 μg/mL鏈霉素、500 μg/mL青霉素的無血清RPMI 1640沖洗，剪碎組織，加入2倍體積的1 mg/mL中性蛋白酶，37 ℃消化60 min，收集單個及小塊組織的瘤細胞，離心洗滌2次，收集單個及小塊組織的瘤細胞接種于150 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為含20%FCS的RPMI-1640/DMEM。次日棄上清液，換新鮮培養(yǎng)液，此后每隔3 d換液1次。

1.2.2培養(yǎng)細胞生物學特性的鑒定 細胞形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡形態(tài)學觀察：取對數生長期細胞在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底約80%時觀察細胞，并在倒置顯微鏡下拍照；細胞爬片免疫組織化學：(1)將專用爬片泡酸，三蒸水沖洗及高壓消毒后放入干燥箱備用；(2)胰酶消化后制成細胞懸液并計數，調整細胞密度105/mL，將細胞接種于含玻片的培養(yǎng)皿中，置入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)待細胞爬滿玻片后取出玻片，用PBS沖洗2次；(4)將爬片用95%的乙醇固定15 min后用PBS沖洗2次；(5)PBS清洗標本3次各1 min；(6)冰丙酮固定 15 min(或4%多聚甲醛固定30min)；(7)空氣干燥5min后PBS清洗標本3次 各 2 min；(8)0.5%Triton X-100(DPBS配)孵育1次20 min；(9)PBS清洗標本3次各2 min，再3%H2O2(試劑A)孵育15 min；(10)DPBS清洗標本3次各2 min；(11)封閉血清孵育(試劑B)20 min；(12)一抗孵育(滴度1∶200，濕盒)4 ℃ 過夜或37 ℃ 60 min，陰性對照用一抗來源血清；(13)PBS清洗標本3次各5 min；(14)二抗工作液孵育(濕盒試劑C) 37 ℃ 30 min；(15)PBS清洗標本3次各5 min；(16)試劑D(濕盒) 37 ℃ 30 min；(17)PBS清洗標本3次，各5 min；(18)DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色 ) 3～10 min；(19)蒸餾水洗2次1 min；(20)蘇木素復染0.5～1.0 min；(21)自來水洗返藍；(22)梯度乙醇脫水75、85、95，100%各需3 min；(23)二甲苯透明2次各3 min；(24)中性樹膠封片。RT-PCR檢測細胞系c-Kit基因的突變位點狀況如下，上游引物：5-CTG GGT CAC TTT GAT ATG GT-3,下游引物：5-AGC CCT GAC CTT CTG ATT C-3。據PCR反應試劑盒說明書，反應體系：模版c-DNA 5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，Sterile water 18 μL，混勻后加入High Fidelity PCR Master 25 μL，混勻?？偡磻傮w積為50 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；循環(huán)結束后，72 ℃延伸7 min。PCR擴增在PE2400型PCR儀上進行。瓊脂電泳證明擴增成功后。選擇PCR base line substrated 模式進行數據分析和修正。以第4至15個循環(huán)熒光強度值標準差的10倍作為熒光閾值，確定不同處理間的CT值，進行分析。

1.2.3反轉錄病毒的轉染 攜帶有正常c-CBL基因反轉錄病毒轉染：將第3代耐藥GIST細胞，培養(yǎng)24 h后，將逆轉錄病毒按1∶10病毒滴度，加入到培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.4GIST細胞體外藥物敏感性測定(MTT法) 常規(guī)用胰酶消化GIST細胞，離心后棄上清液，用培養(yǎng)基重懸細胞后，接種培養(yǎng)。24 h后，加入不同濃度的藥物，每個濃度設3個復孔并設對照孔。分別培養(yǎng)48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT，4 h后每孔加入二甲基亞砜，振蕩使結晶物混勻，在酶標儀570 nm波長處讀取光密度(A)值。重復3次。存活率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%，抑制率(%)=(1-存活率)×100%。

2 結 果

2.1耐甲磺酸伊馬替尼細胞來源患者 患者男性，29歲，小腸間質瘤復發(fā)伴腹腔轉移。術后免疫組織化學：CD117(+)，CD34(+)，S-100(-)，SMA(-)，Desmin(-)，支持小腸間質瘤伴腹腔內轉移。

2.2耐藥GIST原代細胞生長的培養(yǎng)條件 在細胞分離方法上，使用1 mg/mL中性蛋白酶消化培養(yǎng)方法最容易分離出細胞，最適合耐藥GIST原代細胞生長的培養(yǎng)基是含20%進口的GBICO公司的CFS的RPMI-1640。

2.3原代耐藥GIST細胞的形態(tài)及生長情況 剛分離的耐藥原代細胞大約10 h開始貼壁，48 h伸展開，72 h完全伸展開。原代培養(yǎng)的細胞第5天起開始增殖，第10天可傳代。耐藥GSIT原代細胞在倒置顯微鏡下呈互不重疊的單層，細胞生長呈成纖維細胞狀，為長梭型(圖1)。傳代1～2代后細胞生長加快，3～4 d傳代1次。傳代7～10代后耐藥原代細胞生長變慢，細胞倍增時間延長，細胞皺縮，后出現(xiàn)衰老、死亡。

圖1 原代耐藥GIST形態(tài)學(×200)

圖2 細胞爬片后免疫組織化學示CD117+(×200)

2.4原代耐藥GIST細胞生物學鑒定 細胞爬片后免疫組織化學染色鑒定(CD117+)，即胞質、胞膜中出現(xiàn)棕黃色反應產物(圖2)，為典型GIST表現(xiàn)。Western Blot 檢測耐藥GIST的c-kit表達：Western Blot 檢測耐藥GIST的c-Kit穩(wěn)定表達c-Kit蛋白，該細胞具有典型GIST細胞特征(圖3)。RT-PCR產物測序結果顯示耐藥GIST細胞C-kit突變位點位于第9號外顯子，是編碼丙氨酸和酪氨酸的(502Ala-503Tyr)的6個核苷酸的串聯(lián)重復插入，導致了GIST發(fā)生，RT-PCR檢測c-Kit基因突變位點見圖4。

圖3 耐藥GIST細胞表達c-kit表達情況

圖4 耐藥GIST細胞KIT基因突變位點

2.5耐藥GIST細胞轉染 從熒光顯微鏡觀察結果顯示，1∶10的病毒原液滴度轉染耐藥GIST細胞獲得95%的轉染效率(圖5)。

圖5 熒光顯微鏡結果(×100)

2.6轉染前后耐藥GIST對不同濃度的甲磺酸伊馬替尼作用 轉染前耐藥細胞在1.60 μmol/L濃度時，抑制率未超過50%；但轉然后，在0.10 μmol/L濃度抑制率達到(76.50±1.71)%，繼續(xù)增加濃度，抑制率未發(fā)現(xiàn)明顯升高。轉染前后不同濃度的抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 不同濃度甲磺酸伊馬替尼對轉染前后耐藥GIST作用72 h的抑制率%)

3 討 論

目前國內少見成熟的耐藥GIST細胞株出售，國外已經建立的GIST細胞株有GIST780、GIST-T1、GIST48、GIST882,、GIST430[7-9]。GIST882是經典的敏感細胞，對甲磺酸伊馬替尼高度敏感，但是體外不易培養(yǎng)[10]。本研究結果顯示，經原代培養(yǎng)后，耐藥GIST 細胞在倒置相差顯微鏡下呈團塊樣生長，可見核分裂象，細胞核型為多倍體。在細胞分離方法上，本研究發(fā)現(xiàn)使用1 mg/mL中性蛋白酶消化培養(yǎng)的方法最容易分離出細胞，GIST細胞也最容易爬出。1%胰酶消化法分離的細胞數少，細胞存活率低。而組織塊培養(yǎng)法細胞很難爬出。最適合耐藥GSIT原代細胞生長的培養(yǎng)基是含20%進口的GBICO公司的CFS的RPMI-1640。 同時耐藥GIST細胞在傳代7～10代后細胞生長變慢，細胞倍增時間延長，細胞皺縮，后出現(xiàn)衰老、死亡。所選標本術后組織DNA 測序均提示C-kit 基因第9 外顯子病理性突變，培養(yǎng)耐藥細胞爬片，Western Blot檢測顯示為所培養(yǎng)耐藥細胞CD117+，耐藥細胞穩(wěn)定表達C-kit蛋白，因此表明經培養(yǎng)后原代耐藥GIST保留了人GIST耐藥細胞的生物特性。

本研究甲磺酸伊馬替尼對GIST細胞作用72 h的MTT實驗結果顯示：轉染前耐藥細胞在1.60 μmol/L濃度時，抑制率未超過50%；然而轉然后，在0.10 μmol/L濃度抑制率達到76.5%，繼續(xù)增加濃度，抑制率未發(fā)現(xiàn)明顯升高。提示轉然正常c-CBL后的細胞對甲磺酸伊馬替尼敏感。本研究證實了在耐藥GIST中轉染了正常c-CBL基因后，提高了對甲磺酸伊馬替尼的敏感性，這說明正常的c-CBL在間質瘤中可能起著抑癌基因的作用。c-CBL這種作用與RATHINAM等[6]在慢性髓樣細胞白血病類似。

但是c-CBL基因是如何參與調控GIST細胞增殖、分化，其機制目前不清楚。在白血病細胞研究中發(fā)現(xiàn)c-CBL能和PI3K的p85亞基的相互作用，促使PI3K泛素化并經蛋白酶體降解[11-12]，提示其能負調控PI3K/Akt信號通路。有研究提示c-CBL通過泛素結合酶與受體酪氨酸磷酸化的蛋白質結合，導致其泛素化及降解，而負調控表皮生長因子受體，影響其蛋白表達水平[13]。本研究是初次從宏觀探索c-CBL其在耐藥GIST的作用，轉染正常c-CBL后的耐藥細胞對甲磺酸伊馬替尼敏感性有所提升，但其機制不清楚，有待下一步研究繼續(xù)深入。