李楠靜，黃 娟，張 又，何 菲

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610072；2.四川省人民醫(yī)院血液科，成都 610072； 3．四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率和病死率較高。目前除了化療等傳統(tǒng)治療手段以外，也在探索中西醫(yī)結(jié)合的腫瘤綜合治療方案。華蟾素是從傳統(tǒng)中藥材蟾皮中提取的生物制劑，具有清熱解毒、消腫化瘀等功效，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[1-2]。Rho GTPases是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，參與調(diào)控許多細(xì)胞生理進(jìn)程，Rho家族在腫瘤細(xì)胞中通常呈高表達(dá)，幾乎參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的每一個(gè)重要環(huán)節(jié)，RhoA、Cdc42和Rac1是其中最受關(guān)注的分子[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)華蟾素對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞內(nèi)Rho GTPases(RhoA、Cdc42、Rac1)表達(dá)的影響，為胃癌的綜合治療提供新的理論依據(jù)和選擇方向。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胃癌細(xì)胞系SGC7901(四川大學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子靶向治療實(shí)驗(yàn)室提供)；華蟾素(每支5 mL，安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司)；鼠抗人RhoA、Cdc42、Rac1、β-actin單克隆抗體(美國(guó)BD公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；lipofectamineTM2000、Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞系SGC7901由RPMI 1640 (含10%胎牛血清)， 37 ℃、5%CO2敷箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照每孔2×103密度接種于96孔板,培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后加入華蟾素，使其最終濃度達(dá)到0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)對(duì)照組。分別于藥物培養(yǎng)24、48、72 h進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)更換為100 μL新鮮培養(yǎng)液與10 μL CCK-8試劑混合繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀讀取吸光度(A)值,選擇490 nm和630 nm雙波長(zhǎng),增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3Western blot檢測(cè)RhoA、Cdc42、Rac1蛋白的表達(dá) 收集3種濃度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)華蟾素培養(yǎng)48 h后的SGC7901細(xì)胞，制備細(xì)胞總蛋白，BCA方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取等量的蛋白樣品行12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入RhoA、Cdc42、Rac1抗體4 ℃搖床孵育過(guò)夜,加入熒光二抗避光于室溫振搖2 h，將膜直接置于紅外熒光掃描儀中掃描，與內(nèi)參照β-actin進(jìn)行比較。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA的表達(dá) 收集3種濃度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)華蟾素培養(yǎng)48 h后的SGC7901細(xì)胞，以Trizol試劑提取總RNA，按照PCR試劑盒說(shuō)明書方法反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按表1引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,57 ℃退火45 s,72 ℃延伸30 s，共36個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)72 ℃延伸5 min,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，凝膠圖象分析儀進(jìn)行條帶分析。

表1 RT-PCR所用引物序列

2 結(jié) 果

2.1華蟾素對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖活性的影響 隨著華蟾素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖抑制作用也在逐漸增強(qiáng)，呈劑量及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，各濃度華蟾素組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 華蟾素對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響

a：P<0.05,與對(duì)照組比較

2.2華蟾素對(duì)SGC7901細(xì)胞RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表達(dá)的影響 隨著藥物濃度的增加，RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)劑量達(dá)到2.0 mg/mL的時(shí)候蛋白表達(dá)量最低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)各組SGC7901細(xì)胞中RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表達(dá)

2.3華蟾素對(duì)SGC7901細(xì)胞RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表達(dá)的影響 隨著藥物濃度的增加，RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表達(dá)量逐漸降低，顯示出劑量依賴性，各濃度華蟾素組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 華蟾素對(duì)SGC7901細(xì)胞中RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表達(dá)的影響

a：P<0.05,與對(duì)照組比較

3 討 論

胃癌是最常見的惡性腫瘤，是世界上第2大癌癥死因。我國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和病死率高居各種惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命，胃癌目前臨床上主要采用以5-FU為基礎(chǔ)的化療方案[5]，然而胃癌5年相對(duì)生存期仍然很低，探索新的有效抗腫瘤成分的藥物和對(duì)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響成為近年來(lái)腫瘤研究的重點(diǎn)。華蟾素是以中華大蟾蜍皮為主要原料制成的一種水溶性制劑,具有清熱解毒，消腫化瘀等作用。研究發(fā)現(xiàn)華蟾素對(duì)肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有較強(qiáng)的抑制作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和促進(jìn)凋亡，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性[6-9]。

Rho GTPases家族均有與GTP結(jié)合的基因序列，與GDP和GTP有很高的親和力，能夠接收多種刺激信號(hào)。Rho家族是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子，可以參與調(diào)控細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附和移動(dòng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、基因轉(zhuǎn)錄等多種生理過(guò)程[10]。作為Rho家族研究最多最具代表性的3個(gè)分子，大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)RhoA、Cdc42、Rac1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要的聯(lián)系，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，加速細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖；促進(jìn)腫瘤血管壁的發(fā)育，加速腫瘤血管的生成；能夠?qū)购妥钄嗉?xì)胞的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而抑制細(xì)胞的凋亡[11-13]。目前多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)RhoA、Cdc42、Rac1在胃癌細(xì)胞和組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[14-15]，本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)研究不同濃度華蟾素對(duì)胃癌細(xì)胞中RhoA、Cdc42、Rac1基因表達(dá)的影響，探討華蟾素通過(guò)Rho GTPases信號(hào)通路抗胃癌的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)首先采用CCK-8法檢測(cè)4種(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)不同濃度華蟾素作用于SGC7901細(xì)胞24、48、72 h后的增殖活性，顯示各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比增殖活性受到明顯抑制，0.5 mg/mL濃度的華蟾素對(duì)SGC7901細(xì)胞即有抑制作用，2.0 mg/mL濃度的華蟾素在72 h時(shí)抑制率為最高，增殖抑制率呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)得到的有效濃度范圍中，選擇3種(0.5、1.0、2.0 mg/mL)不同濃度華蟾素，用Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)其作用于SGC7901細(xì)胞48 h后RhoA、Cdc42、Rac1蛋白和基因表達(dá)，顯示RhoA、Cdc42、Rac1蛋白和mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組降低，且隨著華蟾素濃度的增加，3種分子的蛋白和mRNA表達(dá)量逐漸降低，2.0 mg/mL濃度的華蟾素抑制蛋白和mRNA表達(dá)作用最強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性。表明華蟾素可以降低胃癌SGC7901細(xì)胞中Rho GTPase的表達(dá)，通過(guò)抑制Rho家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)分子的表達(dá)來(lái)降低細(xì)胞的增殖能力，從而起到抗腫瘤的作用。本實(shí)驗(yàn)為華蟾素抗胃癌的作用機(jī)制提供新的研究方向，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。