陳益國(guó),鄧林強(qiáng),陳 會(huì),熊章華,桂曉美,曾黎峰,喻金梅

(1.江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330008；2.江西省婦幼保健院腫瘤科 南昌330006)

金黃色葡萄球菌是院內(nèi)感染率較高的細(xì)菌之一，自上世紀(jì)60年代檢出第1株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以來(lái)，其分離率已逐年上升，目前MRSA已由院內(nèi)感染擴(kuò)展到社區(qū)[1-2]，自2002年以來(lái)，耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌分離逐年增加[3]，使臨床用藥面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)[4]。因此，尋找免疫學(xué)治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌感染已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)， TLR2受體是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的主要模式識(shí)別受體。本課題組前期研究表明，TLR2受體合成配基Pam3Csk4預(yù)處理小鼠能顯著降低MRSA小鼠肺炎模型的病死率，并在體外能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的殺菌功能[5-6]，提示Pam3Csk4能增強(qiáng)感染動(dòng)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抵抗能力，由于金黃色葡萄球菌血流感染后，臟器膿腫是常見(jiàn)并發(fā)癥之一，所形成膿腫可源源不斷地提供感染源，是金黃色葡萄球菌感染久治不愈的常見(jiàn)原因之一。因此本研究擬用亞致死劑量的MRSA進(jìn)行小鼠造模，探索Pam3Csk4對(duì)金黃色葡萄球菌感染后對(duì)腎臟的保護(hù)功能。

1 材料與方法

1.1材料 18～22 g的SPF級(jí)昆明(KM)小鼠購(gòu)自于江西省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株 (MRSA，ATCC43300)于本室保存；PE/CY5.5-anti- Gr-1,PE-anti-CD11b 來(lái)源于biolegend公司(美國(guó))，膠原酶Ⅰ和DNAse來(lái)源于美國(guó)sigma公司，RT-PCR和Q-PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(日本)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Beckman低溫冷凍高速離心機(jī)、CO2恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱和 Q-PCR儀(CFX96)由江西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1引物合成 由上海英韋創(chuàng)津公司合成下列引物序列，見(jiàn)表1。

1.2.2MRSA制備 將MRSA轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板，18～24 h后挑選單個(gè)菌落移種于LB培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h到對(duì)數(shù)期，4 ℃ 6 000×g離心10 min,留取沉淀，無(wú)菌pH 7.4 PBS洗5次后重懸，細(xì)菌數(shù)按照文獻(xiàn)[6]計(jì)算后備用。

1.2.3腎膿腫模型 MRSA菌懸液制備同前，將所得菌懸液稀釋至每100 μL含1×108CFU MRSA，尾靜脈注射每只100 μL，Pam3Csk4預(yù)處理劑量每只50 μg，注射體積每只100 μL，每組動(dòng)物4只，3、7 d后斷頸處死并收集腎臟觀察小鼠膿腫腎個(gè)數(shù)和切片作HE染色，觀察膿腫大小和數(shù)量、WBC浸潤(rùn)情況。

1.2.4腎臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)流式檢測(cè) 將小鼠分為未處理正常小鼠組、生理鹽水組和Pam3Csk4處理組共3組，每組4只，Pam3Csk4處理組按每只50 μg尾靜脈注射Pam3Csk4，生理鹽水組注射體積每只100 μL生理鹽水。除未處理正常小鼠組外，Pam3Csk4或生理鹽水處理24 h后以每只1×108CFU的MRSA 尾靜脈攻擊，攻擊小鼠攻擊12 h后斷頸處死并摘取左腎，勻漿，胰酶消化，腎中性粒細(xì)胞制備按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行，即用10 U/mL膠原酶Ⅰ和2 μg /mL的DNAs消化30 min，離心收集細(xì)胞后加入進(jìn)行PE/CY5.5 Gr-1和PE-anti-CD11b室溫孵育30 min后，1×PBS洗3次，4%多聚甲醛固定后檢測(cè)。

1.2.5腎組織PCR 將雌性20～22 g SPF級(jí)的KM小鼠分成組，每組動(dòng)物4只，Pam3Csk4預(yù)處理劑量每只50 μg。 MRSA亞致死量感染細(xì)菌量為每只1×108CFU，尾靜脈注射。攻擊小鼠6、12 h后斷頸處死并摘取左腎、勻漿。Q-PCR按參考文獻(xiàn)[7]略有改動(dòng)進(jìn)行，按TaKaRa試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Q-PCR；反轉(zhuǎn)錄條件按TakaRa提供方法進(jìn)行；Q-PCR：95 ℃變性5 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35～40個(gè)循環(huán)。

表1 cDNA序列

2 結(jié) 果

2.1Pam3Csk4預(yù)處理抑制MRSA導(dǎo)致的腎膿腫 Pam3Csk4預(yù)處理小鼠感染MRSA后，膿腫主要在集中于腎臟，MRSA感染3、7 d Pam3Csk4處理組膿腫腎數(shù)量少于生理鹽水組(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖1箭頭所示白色部分為腎膿腫，生理鹽水組7 d內(nèi)1只小鼠出現(xiàn)死亡，其余腎臟已變形且膿腫較為明顯，切片結(jié)果顯示Pam3Csk4處理組腎膿腫的病變程度明顯減輕低于生理鹽水組(切片均來(lái)源于左腎)，見(jiàn)圖2。肝組織未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)膿腫，切片也少見(jiàn)膿腫跡象。

表2 MRSA感染后的膿腫腎個(gè)數(shù)(個(gè))

A:生理鹽水組3 d；B:Pam3Csk4處理組3 d；C:生理鹽水組7 d；D:Pam3Csk4處理組7 d

圖1 Pam3Csk4預(yù)處理抑制MRSA導(dǎo)致的腎膿腫大體觀

A:正常小鼠組；B:Pam3Csk4處理組3 d；C:Pam3Csk4處理組7 d；D:生理鹽水組3 d;E生理鹽水組7 d

圖2 Pam3Csk4預(yù)處理抑制MRSA導(dǎo)致的腎膿腫切片(HE×200)

2.2Pam3Csk4預(yù)處理抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn) 流式結(jié)果顯示，MRSA感染后12 h，Pam3Csk4處理組小鼠腎組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為1.5%，低于生理鹽水組(3.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.3Pam3Csk4預(yù)處理抑制小鼠腎臟CXCL1/2 mRNA的表達(dá) Pam3Csk4預(yù)處理后CXCL1/2顯著增強(qiáng)(P<0.01)，但MRSA感染6 h和12 h后，Pam3Csk4處理組小鼠CXCL1/2表達(dá)均低于生理鹽水組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

A:中性粒細(xì)胞值；B:正常小鼠組；C:Pam3Csk4處理組；D:生理鹽水組；b:P<0.01

圖3 Pam3Csk4預(yù)處理抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)

A：MRSA感染后6 h；B：MRSA感染后12 h；a：P<0.05，b：P<0.01

圖4 MRSA感染后小鼠腎臟CXCL1/2基因表達(dá)

2.4Pam3Csk4預(yù)處理降低MRSA感染后腎臟炎癥介質(zhì)的釋放 在感染后不同時(shí)間點(diǎn)，Pam3Csk4預(yù)處理顯著限制感染小鼠炎癥介質(zhì)TNF-α、 IL-1β和 IL-6而促進(jìn)抗炎因子IL-10基因表達(dá)，見(jiàn)圖5。

2.5Pam3Csk4預(yù)處理降低小鼠腎組織HGMP1和HSP70基因表達(dá) Pam3Csk4預(yù)處理小鼠在MRSA感染6 h內(nèi)與生理鹽水組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但12 h能顯著降低HSP70和HGMP1的基因表達(dá)，見(jiàn)圖6。

2.6Pam3Csk4預(yù)處理增強(qiáng)小鼠腎組織FcγRⅢ和CR3基因表達(dá) 在6、12 h時(shí)間點(diǎn)Pam3Csk4處理組CR3和FcγRⅢ均顯著高于生理鹽水組，而CR3在感染后6 h Pam3Csk4處理組與生理鹽水組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在感染12 h后Pam3Csk4處理組顯著高于生理鹽水組，見(jiàn)圖7。

A：MRSA感染后 6 h；B：MRSA感染后12 h；a：P<0.05；b:P<0.01

圖5 MRSA感染后腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的mRNA表達(dá)

A：MRSA感染后 6 h；B：MRSA感染后12 h；a：P<0.05

圖6 Pam3Csk4預(yù)處理降低小鼠腎臟HGMP1和HSP70的表達(dá)

A：MRSA感染后 6 h ； B：MRSA感染后12 h；a：P<0.01

圖7 Pam3Csk4預(yù)處理增強(qiáng)FCr R Ⅲ和CR3的表達(dá)

3 討 論

金黃色葡萄球菌血流感染后，臟器膿腫是常見(jiàn)并發(fā)癥之一,所形成膿腫可源源不斷地提供感染源，是金黃色葡萄球菌慢性感染久治不愈的常見(jiàn)原因之一，因此本研究探索Pam3Csk4是否能抑制金黃色葡萄球菌內(nèi)臟膿腫的形成；本研究結(jié)果顯示，MRSA感染小鼠，肝組織未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)膿腫，切片也少見(jiàn)膿腫跡象，Pam3Csk4預(yù)處理后，膿腫主要集中于腎臟，MRSA感染3 d和7 d的結(jié)果顯示，Pam3Csk4處理組腎臟膿腫數(shù)量顯著減少，切片結(jié)果顯示其腎膿腫的病變程度明顯減輕低于生理鹽水處理組。

中性粒細(xì)胞是天然抗感染免疫的一線細(xì)胞[7]，當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入機(jī)體后，中性粒細(xì)胞快速聚集到感染部位，從而發(fā)揮抗感染作用，但過(guò)度的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)也會(huì)導(dǎo)致不同程度組織損傷和過(guò)度炎性反應(yīng)[8]。另一方面，中性粒細(xì)胞刪除的小鼠也能顯著降低其細(xì)菌清除率和感染動(dòng)物的存活時(shí)間[9]，因此適當(dāng)控制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)具有重要意義。與以往研究[10]一致,本研究結(jié)果表明,預(yù)處理Pam3Csk4減少M(fèi)RSA感染小鼠腎臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。進(jìn)一步研究表明,這種現(xiàn)象可能與降低中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL1/2及細(xì)胞表面趨化性受體表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制可能通過(guò)限制機(jī)體中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)而抑制因過(guò)度中性粒細(xì)胞聚集而導(dǎo)致的過(guò)度炎性反應(yīng)[11]。本課題組前期已發(fā)表數(shù)據(jù)顯示，Pam3CSK4鼻腔滴注也能顯著降低MRSA感染后肺部中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[5]，但如何控制中性粒細(xì)胞的聚集量目前仍然是亟待解決的問(wèn)題。

對(duì)于感染患者來(lái)說(shuō)，過(guò)度的炎性反應(yīng)往往是其死亡的重要因素[12]，因此本研究對(duì)小鼠感染后腎臟炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pam3Csk4的預(yù)處理能抑制MRSA感染小鼠腎組織促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，并且提高抗炎癥因子IL-10的釋放，提示Pam3Csk4預(yù)處理能抑制MRSA感染導(dǎo)致的過(guò)度炎性反應(yīng)。

HGMP1和HSP70反應(yīng)急性腎腎損傷的重要炎癥指標(biāo)，HGMP1和HSP70的表達(dá)增加能增加腎臟的炎性反應(yīng)和腎細(xì)胞的急性損傷[13]。本研究表明，Pam3Csk4預(yù)處理小鼠在金黃色葡萄球菌感染6 h內(nèi)與對(duì)照組比較無(wú)顯著變化，但能顯著降低12 h后HGMP1和HSP70的mRNA表達(dá)，提示Pam3Csk4能降低金黃色葡萄球菌感染小鼠腎臟的炎性反應(yīng)。

調(diào)理吞噬是機(jī)體抗菌免疫重要機(jī)制，其中調(diào)理性Fcγ受體分為3類[14]，通過(guò)結(jié)合不同的IgG亞型發(fā)揮調(diào)理吞噬作用，有研究報(bào)道TLR2激動(dòng)劑處理能增強(qiáng)外周血單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和體外抗菌能力[15]。本研究結(jié)果表明,Pam3Csk4預(yù)處理能增強(qiáng)MRSA感染后腎FCγRⅢ基因表達(dá)，但單獨(dú)Pam3Csk4預(yù)處理后其表達(dá)水平增加不明顯，其潛在機(jī)制尚不明確。補(bǔ)體受體為另一類調(diào)理吞噬性受體,可通過(guò)結(jié)合與細(xì)菌結(jié)合的C3b和iC3b而發(fā)揮補(bǔ)體參與的殺菌作用，文獻(xiàn)研究表明，機(jī)體感染病原微生物后補(bǔ)體受體的表達(dá)水平增加[15]。因此，本研究也檢測(cè)腎組織中補(bǔ)體受體的表達(dá)，結(jié)果表明，Pam3Csk4預(yù)處理也能顯著增強(qiáng)CR3的表達(dá)。結(jié)合上述研究結(jié)果提示，Pam3Csk4預(yù)處理增強(qiáng)的細(xì)菌清除率可能與增強(qiáng)腎組織免疫細(xì)胞表面調(diào)理吞噬性受體表達(dá)、抑或是增強(qiáng)中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞氧化應(yīng)激、殺菌性蛋白的釋放有關(guān)[5]。

綜上所述，Pam3Csk4預(yù)處理能顯著降低MRSA導(dǎo)致腎膿腫，同時(shí)抑制因MRSA感染所導(dǎo)致的過(guò)度炎性反應(yīng)，降低腎損傷程度，該現(xiàn)象并非增加PMN等免疫細(xì)胞數(shù)量，可能與增強(qiáng)腎組織浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的吞噬功能相關(guān)。