汪維佳 廖志波

【摘要】 目的：以EB病毒相關(guān)性胃癌患者為研究對(duì)象，探究IL-10作為EB病毒型胃癌篩選生物標(biāo)志物的可能性以及p53和β-連環(huán)蛋白水平對(duì)患者治療后預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。方法：納入2014年1月-2015年12月于本院外科接受手術(shù)治療的EB病毒型胃癌患者80例，采集患者血液和少量腫瘤組織；采用Trizol法從新鮮冷凍的腫瘤組織中提取DNA，檢測(cè)EBV DNA，擴(kuò)增EBNA-2基因（巢式PCR）和血清學(xué)檢測(cè)抗體水平；采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織p53蛋白、β-連環(huán)蛋白表達(dá)及定位情況；采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血樣中的IL-10水平；采用COX模型進(jìn)行生存分析。結(jié)果：胃癌患者血清抗EB病毒核抗原（EBNA）、IL-10水平均顯著高于對(duì)照組（t=12.441、11.832，P<0.001）；p53的陽(yáng)性表達(dá)與低癌細(xì)胞分化狀態(tài)、高T分期均存在顯著相關(guān)（P<0.01），與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有密切聯(lián)系（P<0.01）；β-連環(huán)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與低癌細(xì)胞分化狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有著密切聯(lián)系（P<0.01）；在6～24個(gè)月的隨訪觀察期間，p53陽(yáng)性患者、β-連環(huán)蛋白陽(yáng)性患者的生存時(shí)間均顯著短于陰性患者（P<0.05）。結(jié)論：p53、β-連環(huán)蛋白與IL-10聯(lián)合檢測(cè)對(duì)EB病毒相關(guān)性胃癌的早期診斷和疾病預(yù)后評(píng)估具有臨床運(yùn)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 p53； β-連環(huán)蛋白； IL-10； EB病毒； 胃癌

【Abstract】 Objective：To investigate the possibility of IL-10 as a biomarker for EB virus type gastric cancer and evaluate the prognostic value of p53 and β-catenin in the prognosis of patients with EB virus associated gastric cancer.Method：80 patients with type EB virus from January 2014 to December 2015 in our hospital underwent surgical treatment of gastric cancer，the patients blood and a small amount of tumor tissue were collected.DNA was extracted from fresh frozen tumor tissue by Trizol method，EBV DNA was detected，EBNA-2 gene was amplified and antibody level was detected by serology.Detection of the expression and localization of p53 protein，β-catenin in tumor tissues by immunohistochemistry；double antibody sandwich ELISA method was used to detect the level of IL-10 in blood samples；COX model was used for survival analysis.Result：The serum levels of IL-10 against EBV nuclear antigen in gastric cancer patients were significantly higher than those in control group（t=12.441，11.832，P<0.001）；the positive expression of p53 was significantly correlated with the differentiation of low cancer cells and the high T stage（P<0.01），and had a close relationship with lymph node metastasis（P<0.01）.The positive expression of β-catenin was closely related to the low differentiation of cancer cells and lymph node metastasis（P<0.01）.During 6-24 months follow-up，the survival time of β-catenin positive patients was significantly shorter than that of negative patients（P<0.05）.Conclusion：The combined detection of p53，β-catenin and IL-10 has clinical value for the early diagnosis of EB virus related gastric cancer and the evaluation of the prognosis of the disease.

【Key words】 p53； β-catenin； IL-10； EB virus； Gastric cancer

First-authors address：The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University·Yuedong Hospital，Meizhou 514733，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.008

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率在前五的癌癥之一，且是癌癥相關(guān)死亡率第三的癌癥。根據(jù)癌癥聚類研究網(wǎng)站（Cancer Atlas Research Network）數(shù)據(jù)顯示，胃癌分為4類，包括：EB病毒（EBV）陽(yáng)性胃癌、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型胃癌、基因組穩(wěn)定型胃癌和染色體不穩(wěn)定型胃癌。世界上每年有超過95萬(wàn)例的胃腺癌被診斷出來(lái)，估計(jì)這些病例中有10%患者與EBV感染有關(guān)[1-3]。據(jù)估計(jì)，全球每年約有84 000例EBV相關(guān)胃癌被診斷出。EBV陽(yáng)性的胃癌類型構(gòu)成EBV相關(guān)癌癥中最大的組成部分。盡管如此，現(xiàn)有的文獻(xiàn)中關(guān)于胃癌患者血清學(xué)成分分析的研究報(bào)道尚少[4]。在Chen等[5]的薈萃分析中，僅檢索發(fā)現(xiàn)4篇文獻(xiàn)進(jìn)行比較胃癌患者與健康志愿者之間血清抗EBV抗體存在的差異。EBV感染相關(guān)的特定血清學(xué)標(biāo)志物是監(jiān)測(cè)暴露于EBV感染和再激活的有效生物標(biāo)志物指標(biāo)。例如，EB病毒衣殼抗原（EBVCA）提示存在潛伏感染，抗EB病毒核抗原（EBNA）和抗早期抗原（EA）提示潛伏感染再激活。此外，許多研究表明免疫抑制細(xì)胞因子，如IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）在某些類型的癌癥中誘導(dǎo)EBV再激活，在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用[6]。最近來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）的數(shù)據(jù)揭示EBV相關(guān)腫瘤存在PIK3CA突變、PD-L1/2過表達(dá)、EBV-CIMP和CDKN2A沉默表達(dá)，以及免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等分子水平特征[7]。同時(shí)，EBV感染可通過致癌途徑的激活導(dǎo)致宿主細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化事件。文獻(xiàn)[8]研究證實(shí)，基因改變可能在EBV感染的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，包括促進(jìn)病理改變（譬如胃癌）。目前研究表明，p53、β-連環(huán)蛋白和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）均與EBV相關(guān)性胃癌的發(fā)病機(jī)制存在密切關(guān)系。因此，研究這些分子改變可能為EBV相關(guān)胃癌治療靶點(diǎn)提供潛在的新型生物標(biāo)志物且為治療預(yù)后的評(píng)估提供參考依據(jù)。本研究以EB病毒相關(guān)性胃癌患者為研究對(duì)象，探究IL-10作為EB病毒型胃癌篩選生物標(biāo)志物的可能性以及p53和β-連環(huán)蛋白水平對(duì)患者治療后預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2014年1月-2015年12月于本院外科接受手術(shù)治療的EB病毒型胃癌患者80例，所有患者均為幽門螺桿菌陰性。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）手術(shù)治療前未進(jìn)行放療和化療；（3）EB病毒檢測(cè)陽(yáng)性；（4）符合手術(shù)治療指針。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有嚴(yán)重心、腦、呼吸系統(tǒng)疾病，無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療；（2）存在其他嚴(yán)重并發(fā)癥。同時(shí)納入由同一病房因胃癌以外的疾病住院的50例患者組成對(duì)照組。本研究獲本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有納入研究的志愿者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR 采集患者血液和少量腫瘤組織保存于-80 ℃冰箱。采用Trizol法從新鮮冷凍的腫瘤組織中提取DNA，檢測(cè)EBV DNA，擴(kuò)增EBNA-2基因（巢式PCR）和血清學(xué)檢測(cè)抗體水平。根據(jù)文獻(xiàn)[9]所述，根據(jù)外顯子3上的EBV LMP-1亞型的PCR結(jié)果進(jìn)行篩選鑒定，野生型為wt-LMP-1、缺失型為del-LMP-1。

1.2.2 免疫組化 將適量胃癌組織置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，而后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明及浸蠟處理；使用萊卡包埋機(jī)進(jìn)行包埋石蠟塊，RM2016切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，厚度5 μm。石蠟切片置于65 ℃烤箱中過夜，而后梯度脫蠟、水化。水化后的組織切片上滴加3%過氧化氫溶液以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；而后切片進(jìn)行酸性修復(fù)，采用預(yù)先配置好的檸檬酸鹽緩沖液，切片置于液體中，采用微波加熱法進(jìn)行。待修復(fù)結(jié)束后予以1%BSA室溫封閉30 min，加一抗于4 ℃過夜（p53：1∶800，abcam；β-連環(huán)蛋白：1∶200，abcam）。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶200）于組織切片，室溫孵育1 h。采用DAB顯色后，蘇木素染核1 min，而后進(jìn)行脫水和中性樹脂封片。采用正置顯微鏡觀察切片陽(yáng)性信號(hào)，并進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。免疫組織化學(xué)結(jié)果定義如下：在至少50%的腫瘤細(xì)胞核中存在強(qiáng)p53于核表達(dá)被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果，在至少10%的細(xì)胞質(zhì)核中存在強(qiáng)β-連環(huán)蛋白表達(dá)被定義為陽(yáng)性結(jié)果。免疫組織化學(xué)分析同時(shí)由兩位病理科醫(yī)生進(jìn)行。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)IL-10 于清晨分別采集80例患者與50例健康志愿者的外周血5 mL，即刻送檢，利用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血樣中的IL-10水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0（SPSS Inc，Illinois，USA）統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間方差不齊用校正t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用卡方檢驗(yàn)，生存分析采用COX檢驗(yàn)。定義P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組的年齡、性別、吸煙、EB相關(guān)抗體陽(yáng)性比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。80例胃癌患者的相關(guān)特征參數(shù)分析， GTNM（G為癌細(xì)胞分化等級(jí)，T為腫瘤組織大小分級(jí)情況，N為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，M為轉(zhuǎn)移情況）分級(jí)情況：G1 18例、G2 42例、G3 20例，T1 16例、T2 48例、T3 16例，N0 30例、N1 23例、N2 17例、N3 10例，M0 80例；癌灶部位分布情況：幽門部39例，胃體22例，賁門部59例；EB病毒類型：野生型（wt-LMP-1）59例，缺失型（del-LMP-1）21例。

2.2 兩組血清IL-10、EBNA的表達(dá)水平比較 胃癌患者血清抗EB病毒核抗原（EBNA）水平顯著高于對(duì)照組（P<0.001）；同時(shí)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EB病毒相關(guān)的胃癌患者血清IL-10水平明顯高于健康志愿者水平（P<0.001），見表2。

2.3 p53、β-連環(huán)蛋白與EB型胃癌臨床參數(shù)相關(guān)性 在80例腫瘤組織中進(jìn)行p53的免疫組織化學(xué)染色，其中20個(gè)（25.0%）組織測(cè)試為陽(yáng)性。p53的陽(yáng)性表達(dá)與低癌細(xì)胞分化狀態(tài)、高T分期均存在顯著相關(guān)（P<0.01），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有密切聯(lián)系（P<0.01）。同時(shí)，對(duì)80例腫瘤組織進(jìn)行β-連環(huán)蛋白表達(dá)的檢查，結(jié)果顯示：β-連環(huán)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與低癌細(xì)胞分化狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有著密切聯(lián)系（P<0.01）。見表3、4。

2.4 生存分析 采用COX函數(shù)對(duì)80例患者進(jìn)行生存分析，分別分析p53陽(yáng)性、β-連環(huán)蛋白的陽(yáng)性胃癌患者與陰性患者之間生存情況差異。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在6～24個(gè)月的隨訪觀察期間，p53、β-連環(huán)蛋白陽(yáng)性患者的生存時(shí)間均顯著短于陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1、2。

3 討論

胃癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中EB病毒相關(guān)性胃癌常見于中青年群體。EBVa胃癌（GC）在年齡50～68歲的患者中更常見，而EBV陰性胃癌在56～72歲患者中更為常見[10]。目前研究已經(jīng)確定的促進(jìn)EBVaGC發(fā)生的幾個(gè)危險(xiǎn)因素，譬如吸煙。在本研究中，60歲以上的男性占據(jù)62.5%，其中大多數(shù)（62.5%）是吸煙者。EBV在世界范圍內(nèi)普遍存在，大約95%的人群可被檢測(cè)到EBV相關(guān)抗體的存在。據(jù)統(tǒng)計(jì)，EBNA IgG和EBVCA IgG在癌癥患者和對(duì)照組中均比其他抗體檢測(cè)更為頻繁[11-12]。在本研究中，胃癌組和對(duì)照組中的抗EBVCA和抗EBNA的檢測(cè)率相接近，盡管兩個(gè)抗體的滴度在各組之間存在差異，這提示兩者在EBVaGC患者中表達(dá)水平更高。此外，本研究中72.5%的GC患者中發(fā)現(xiàn)抗EA抗體，且50%患者抗體滴度檢測(cè)呈現(xiàn)高效價(jià)，而在對(duì)照組中僅在8.0%中檢測(cè)到，且是低滴度水平。因此，同時(shí)具有高抗EBVCA和抗EBNA水平的高抗EA效價(jià)可能提示GC患者存在EBV感染的再激活。

免疫抑制因子（如IL-10）在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。EB病毒可表達(dá)分泌IL-10因子（vIL-10），其與人IL-10（hIL-10）存在高度同源性，EB病毒在裂解期后期以及在B淋巴細(xì)胞感染發(fā)作時(shí)可分泌大量vIL-10，導(dǎo)致患者血清IL-10水平明顯上升[13]。此外，文獻(xiàn)[14]研究表明，IL-10水平在GC患者血清中高于對(duì)照組，因此可用于預(yù)測(cè)GC發(fā)生，特別是可用于評(píng)估疾病進(jìn)展。

據(jù)報(bào)道，p53的突變與胃癌的發(fā)生發(fā)展階段存在密切相關(guān)，且EBVaGC組織中晚期和p53過表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)[15]。然而目前尚對(duì)p53與GC預(yù)后之間關(guān)聯(lián)性的研究報(bào)道尚少。迄今為止，免疫組織化學(xué)檢測(cè)p53表達(dá)對(duì)胃癌預(yù)后的影響仍然存在爭(zhēng)議，一些研究將p53表達(dá)缺失與更長(zhǎng)的生存期聯(lián)系起來(lái)，這意味著p53是一個(gè)負(fù)面的預(yù)后因素。相反，其他研究表明，未發(fā)現(xiàn)p53表達(dá)與生存率之間的關(guān)系[16-17]。本研究結(jié)果表明p53陰性患者存在更長(zhǎng)的生存時(shí)間。β-連環(huán)蛋白已被證明是Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)[18]。作為Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)中心分子，β-連環(huán)蛋白表達(dá)位于膜，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核β-連環(huán)蛋白主要參與Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞核中累積并激活靶基因的表達(dá)程序，并喪失E-鈣粘蛋白，促進(jìn)上皮-間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)場(chǎng)，促進(jìn)癌癥發(fā)生。本研究結(jié)果表明β-連環(huán)蛋白陰性患者也存在更長(zhǎng)的生存時(shí)間。

綜上，p53、β-連環(huán)蛋白與IL-10聯(lián)合檢測(cè)對(duì)EB病毒相關(guān)性胃癌的早期診斷和疾病預(yù)后評(píng)估存在一定的臨床運(yùn)用價(jià)值。

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