周 進(jìn)，張美玲，張 俐，李翠霞，趙慧穎，張友林，夏安東，孔祥貴*

(1.發(fā)光學(xué)及應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林長春 130033;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049; 3.吉林大學(xué)，長春 130012; 4.中國科學(xué)院化學(xué)研究所，北京 100190)

1 引 言

血液免疫檢測是醫(yī)學(xué)臨床疾病診斷的重要手段［1］。在各種血液免疫檢測方法中，熒光標(biāo)記物為基礎(chǔ)的光學(xué)免疫檢測由于其檢測方法相對簡單并且具有較高的靈敏度在臨床疾病診斷及監(jiān)測中得到了廣泛的應(yīng)用［2-3］。目前普遍應(yīng)用的熒光標(biāo)志物的激發(fā)光均為紫外或可見光，血液中檢測時，會激發(fā)血液產(chǎn)生熒光背景，湮滅探針的熒光信號［4］。因此，目前臨床應(yīng)用的光學(xué)檢測技術(shù)，都必須預(yù)先進(jìn)行血清/血漿分離，而多次的分離及清洗過程不可避免地會對待測生物分子的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象造成破壞，從而對檢測的準(zhǔn)確性造成影響，導(dǎo)致錯誤的治療方案，后果極其嚴(yán)重。

基于此，找到一種可以克服上述缺點(diǎn)的新的熒光標(biāo)記材料顯得尤為重要。稀土元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs，例如 NaYF4∶Yb，Er/Tm)能夠吸收紅外光(980 nm)替代以往的紫外和可見光激發(fā)，通過多光子吸收過程將近紅外光子上轉(zhuǎn)換到可見光/近紅外區(qū)域［5］。由于生物分子本身對近紅外光吸收較弱，這種低能量的非入侵式激發(fā)會將對生物樣品的光損傷降到很小，同時也意味著背景熒光和雜散光的信號極其微弱。另外，由于稀土離子(例如Er3+、Tm3+和Yb3+)的4f電子受到最外層5s電子屏蔽作用，其發(fā)光性質(zhì)受環(huán)境變化的影響很小，具有發(fā)射譜線窄、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、熒光壽命長、生物毒性低、光譜峰位隨摻雜稀土離子變化可調(diào)等特點(diǎn)［6-10］，在細(xì)胞及生物體成像［11］、核酸分子檢測［12］以及光動力學(xué)治療方面［13］都得到了廣泛的應(yīng)用。尤其最近，UCNPs作為一種新型的熒光標(biāo)記材料已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。如何發(fā)展基于UCNPs的高特異性、高靈敏度固相免疫載體成為科學(xué)研究及應(yīng)用方面亟待解決的問題。

在本文中，我們選擇 NaYF4∶Yb3+，Tm3+上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子作為標(biāo)記物，其激發(fā)(980 nm)和發(fā)射(800 nm)波段均位于生物窗口內(nèi)，可以有效避免生物熒光背景的產(chǎn)生。進(jìn)一步，利用這種近紅外發(fā)光探針及生物功能化修飾的硅片構(gòu)筑雙抗體發(fā)光免疫夾心檢測體系。首先，以共價偶聯(lián)的方式把human IgG修飾到聚丙烯酸包覆的UCNPs的表面，作為發(fā)光探針(H端);特別地，為了提高r-a-g IgG分子活性以及控制其活性端的取向，我們創(chuàng)新性地引入protein G作“橋”將r-a-g IgG修飾在硅片表面(R端)。當(dāng)把修飾好的硅片植入含有g(shù)-a-h IgG檢測溶液中時，利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，會將UCNPs連接到硅片上。通過測量硅片上的上轉(zhuǎn)換發(fā)光，從而實(shí)現(xiàn)g-a-h IgG的高特異性、高靈敏的檢測。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)中使用的試劑如下:YCl3·6H2O(99.9%)、YbCl3·6H2O(99.99%)、TmCl3·6H2O(99.99%)、油酸(90%)、1-十八烯 (90%)、PAA 等材料購自 Sigma-Aldrich。戊二醛、human IgG、r-a-g IgG、g-a-h IgG和兔抗鼠IgG(r-a-m IgG)購自北京鼎國生物試劑公司，均為分析純或化學(xué)純級別。

實(shí)驗(yàn)中使用的儀器如下:臺式離心機(jī)(型號為GT10-1);980 nm半導(dǎo)體二極管激光器;X射線衍射儀(Bruker D8-advance);納米粒徑電位分析儀(Nano-ZS Zetasizer ZEN3600);原子力顯微鏡(Bruker Multimode 8);日立F-4500熒光光譜儀。

2.2 NaYF4∶24.7%Yb3+，0.3%Tm3+上轉(zhuǎn)換納米粒子的合成

將 0.75 mmol的 YCl3、0.247 mmol的 YbCl3、0.003 mmol的TmCl3粉末和6 mL油酸、15 mL的1-十八烯依次加入到100 mL的三頸瓶中，通氬氣并攪拌，緩慢升溫到160℃。稀土氯化物完全溶解后，降溫到30℃，加入含100 mg NaOH和148 mg NH4F的甲醇溶液。將體系升溫到70℃，保持50 min以完全除去溶液中的甲醇。緩慢升溫至300℃(10℃/min)，反應(yīng)1.5 h后降溫至30℃，得到的溶液用丙酮進(jìn)行沉化，離心3遍后分散在8 mL環(huán)己烷中備用。

2.3 上轉(zhuǎn)換納米粒子表面修飾human IgG

將上述制備的溶液8 mL(含有160 mg UCNPs)加入8 mL HCl溶液(0.1 mol/L)中，振蕩12 h，抽取下層鹽酸溶液離心2次(11 500 r/min離心20 min)。然后加入1 mL PAA溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，pH值用5 mol/L的NaOH調(diào)至9)，超聲3 min溶解后室溫振蕩過夜，離心后得到PAA修飾的UCNPs(UCNPs-PAA)，在 PBS中具有良好的分散性。將 EDC(4 mmol/L)和NHS(10 mmol/L)加入2 mL PBS溶液中(5 mg PAA-UCNPs)活化羧基，再加入0.5 mg human IgG，室溫振蕩2 h后離心，得到human IgG修飾的UCNPs(UCNPs-PAA-h-IgG)。

2.4 固相載體表面修飾r-a-g IgG

依次用丙酮、三氯乙烯和乙醇等清洗硅片，加入濃鹽酸和甲醇混合液(V∶V=1∶1)，反應(yīng)30 min，干燥后加入過氧化氫和濃硫酸混合液(V∶V=3∶7)進(jìn)行羥基化，緩慢油浴升溫至80℃，反應(yīng)2 h，沖洗烘干。再分別用10%的APTES乙醇溶液和5%的戊二醛甲醇溶液(加入0.1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氰基硼氫化鈉)進(jìn)行氨基和醛基化修飾，清洗后置入0.1 mg/mL的protein G溶液中，4℃過夜。然后加入0.2 mg/mL r-a-g IgG，4℃下反應(yīng)12 h后加入1%的BSA封閉未結(jié)合位點(diǎn)，反應(yīng)2 h，得到r-a-g IgG修飾的硅片。

2.5 緩沖液中g(shù)-a-h IgG的定量免疫檢測

將g-a-h IgG加入UCNPs-PAA-h-IgG溶液，最終濃度分別為 5，10，20，50，100，200，300，400，500，600 nmol/L。將r-a-g IgG修飾的硅片插入400 nmol/L的溶液中，每隔10 min測一次980 nm激發(fā)下硅片的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜(即10，20，30，40 min)，直到發(fā)光強(qiáng)度飽和，以此確定最佳檢測時間。然后將功能化硅片插入上述不同濃度的g-a-h IgG溶液，充分反應(yīng)后測量硅片的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜，每個濃度均進(jìn)行5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)以保證結(jié)果準(zhǔn)確性。

2.6 免疫檢測的特異性研究

按照上述方法分別配制2 mg/mL的rabbit IgG溶液、2 mg/mL的r-a-m IgG溶液和20 mg/mL的BSA溶液，將功能化硅片分別插入，測量反應(yīng)后的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 上轉(zhuǎn)換納米粒子的表征

本實(shí)驗(yàn)中，我們以氯化物為原料通過溶劑熱法合成了尺寸均勻的NaYF4∶Yb3+，Tm3+上轉(zhuǎn)換納米粒子。圖1(a)給出了UCNPs的掃描電鏡圖像，其顯示納米粒子尺寸分布為(23±1)nm。由此獲得尺寸均勻的納米顆粒為后續(xù)熒光標(biāo)記免疫檢測的重復(fù)性和精確性奠定了良好的材料基礎(chǔ)。

樣品的X射線衍射(XRD)圖如圖1(b)所示，其X衍射峰位置與標(biāo)準(zhǔn)卡片 JCPDS No.16-0334相一致，表明合成的樣品是純六角相，由于六角相UCNPs的發(fā)光效率比立方相高近一個數(shù)量級，這為后續(xù)的高靈敏檢測提供了條件。

圖1 (a)NaYF4∶Yb3+，Tm3+上轉(zhuǎn)換納米粒子的掃描電鏡照片;(b)NaYF4∶Yb3+，Tm3+上轉(zhuǎn)換納米粒子的XRD衍射圖。Fig.1 SEM image(a)and XRD pattern(b)of NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs

3.2 上轉(zhuǎn)換納米粒子與human IgG蛋白偶聯(lián)(H端)

我們利用去配體法將UCNPs從油相轉(zhuǎn)移為水相，并且通過PAA引入了可以進(jìn)一步生物功能化修飾的活性基團(tuán)——羧基，和human IgG表面的氨基進(jìn)行偶聯(lián)。

我們通過動態(tài)光散射技術(shù)(DLS)對其進(jìn)行表征，DLS是通過測量散射顆粒產(chǎn)生的微小頻移及其角度依賴性來獲取粒子的尺寸分布，廣泛應(yīng)用于納米粒子表面修飾的表征。由于DLS測得的結(jié)果是流體動力學(xué)直徑，并不是粒子的真實(shí)直徑，在粒子表面基團(tuán)的作用下，測得的粒子尺寸比SEM測得的要大，但是仍可以用來定性表征粒子的尺寸變化［14］。圖2是UCNPs-PAA和UCNPs-PAA-h-IgG的DLS粒徑分布圖，顯示偶聯(lián)human IgG后，粒子流體動力學(xué)直徑由90 nm增大至290 nm，說明 human IgG已經(jīng)成功偶聯(lián)在 UCNPs表面［15］。

圖2 (a)PAA修飾的的NaYF4∶Yb3+，Tm3+上轉(zhuǎn)換納米粒子的DLS粒徑分布圖;(b)在 (a)基礎(chǔ)上繼續(xù)偶聯(lián)human IgG的上轉(zhuǎn)換納米粒子的DLS粒徑分布圖。Fig.2 Particle size distribution image of UCNPs-PAA(a)and UCNPs-PAA-h-IgG(b)by DLS

3.3 硅片上修飾r-a-g IgG蛋白(R端)

同時，我們利用 Protein G作“橋”，將 r-a-g IgG修飾在硅片表面，以此提高r-a-g IgG分子活性以及控制其活性端的取向。由于原子力顯微鏡(AFM)具有原子級的高分辨率，我們利用AFM對硅片表面抗體偶聯(lián)進(jìn)行了表征。經(jīng)過多步清洗過程，我們排除了物理性吸附的分子對結(jié)果的影響。硅片表面平整度約為1～2 nm(圖3(a))，連接protein G后高度約為4～6 nm(圖3(b))，說明在硅片上成功修飾上protein G。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)修飾r-a-g IgG，高度約為15～17 nm(圖3(c))?？紤]protein G、r-a-g IgG的高度分別約為3 nm和14 nm，表征結(jié)果略小于該高度，這可能是由于測試過程中探針針端的壓力引起的。由于protein G特異性結(jié)合抗體的Fc區(qū)域(Fab區(qū)域?yàn)榭贵w抗原結(jié)合位點(diǎn))，實(shí)現(xiàn)了硅片和抗體的“柔性偶聯(lián)”，為后續(xù)檢測的高靈敏度提供了有力保障。

圖3 (a)硅片表面的原子力顯微鏡成像圖;(b)硅片表面修飾protein G的原子力顯微鏡成像圖;(c)在(b)基礎(chǔ)上繼續(xù)修飾r-a-g IgG的原子力顯微鏡成像圖。Fig.3 AFM images of the silicon wafer surface(a)，silicon wafer surface modified with protein G(b);silicon wafer surface modified with protein G and r-a-g IgG(c)，respectively.

3.4 檢測物g-a-h IgG的定量檢測

我們對緩沖液中的g-a-h IgG進(jìn)行了定量檢測分析，游離g-a-h IgG先和上轉(zhuǎn)換表面的human IgG(H端)結(jié)合，將功能化硅片插入到g-a-h IgG溶液中后，硅片表面的r-a-g IgG(R端)通過g-a-h IgG和H端相結(jié)合，在980 nm激光的激發(fā)下，可以從硅片表面上測得UCNPs的發(fā)光，最后通過800 nm發(fā)光強(qiáng)度來定量計(jì)算檢測物g-a-h IgG蛋白的濃度，結(jié)果如圖4所示。首先，我們討論了不同檢測反應(yīng)時間對檢測結(jié)果的影響。圖4(a)及(b)給出了g-a-h IgG濃度為400 nmol/L時，經(jīng)過不同反應(yīng)時間后，硅片表面的上轉(zhuǎn)換發(fā)光增強(qiáng)情況。隨著反應(yīng)時間的延長，越來越多的上轉(zhuǎn)換納米粒子被結(jié)合到硅片表面，引起上轉(zhuǎn)換發(fā)光的持續(xù)增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到30 min后，上轉(zhuǎn)換的發(fā)光增強(qiáng)達(dá)到飽和，此后隨著反應(yīng)時間的延長，上轉(zhuǎn)換發(fā)光幾乎不再變化。因此我們采用30 min作為后續(xù)檢測反應(yīng)時間。

圖4 (a)功能化硅片在g-a-h IgG溶液中反應(yīng)不同時間的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜(400 nmol/L);(b)功能化硅片在g-a-h IgG溶液中反應(yīng)不同時間的發(fā)光強(qiáng)度變化(400 nmol/L，800 nm);(c)不同濃度g-a-h IgG檢測的熒光光譜(30 min);(d)熒光強(qiáng)度與g-a-h IgG濃度的關(guān)系圖(30 min，800 nm)。Fig.4 (a)Upconversion luminescence spectra of the bio-functional substrate at different reaction time in buffer(400 nmol/L).(b)Fluorescence intensity on reaction time with the concentration of g-a-h IgG of 400 nmol/L(at 800 nm).(c)Upconversion luminescence spectra of the bio-functional silicon wafer with increasing g-a-h IgG concentrations(30 min).(d)Relationship between the fluorescence intensity at 800 nm and the concentration of g-a-h IgG(30 min).

我們進(jìn)一步研究了這種方法的線性檢測范圍。圖4(c)和(d)給出了不同濃度g-a-h IgG下，功能化硅片的上轉(zhuǎn)換發(fā)光增強(qiáng)情況。隨著溶液中g(shù)-a-h IgG濃度的增加，硅片表面連接的上轉(zhuǎn)換納米粒子增多，熒光強(qiáng)度越來越大，當(dāng)g-a-h IgG濃度達(dá)到400 nmol/L時，發(fā)光達(dá)到飽和，此后g-a-h IgG濃度增加，上轉(zhuǎn)換光強(qiáng)幾乎不再發(fā)生變化。在5～400 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)度和IgG濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.993。根據(jù)3σ IUPAC標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得出該檢測系統(tǒng)的檢測限為1.82 nmol/L。

3.5 固相生物傳感器的特異性研究

圖5 固相生物傳感器用于不同分析物檢測的上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度，由左至右依次為 g-a-h IgG(0.1 mg/mL)、rabbit IgG(2 mg/mL)、r-a-m IgG(2 mg/mL)和BSA(20 mg/mL)。Fig.5 Upconversion luminescence intensity of the bio-functional substrate in the presence of different analytes.From left to right:g-a-h IgG(0.1 mg/mL)，rabbit IgG(2 mg/mL)，r-a-m IgG(2 mg/mL)，and BSA(20 mg/mL)，respectively.

為了評價構(gòu)建的固相生物傳感器檢測蛋白的特異性，我們用上述方法對g-a-h IgG(0.1 mg/mL)、rabbit IgG(2 mg/mL)、r-a-m IgG(2 mg/mL)和BSA蛋白(20 mg/mL)溶液分別進(jìn)行檢測，反應(yīng)30 min后，將硅片用PBS緩沖液沖洗3次，檢測上轉(zhuǎn)換發(fā)光，結(jié)果如圖5所示。在980 nm激光的激發(fā)下，對于有特異性結(jié)合g-a-h IgG蛋白的檢測，硅片上可以看到有明顯的上轉(zhuǎn)換發(fā)光，而其他3個硅片上幾乎沒有發(fā)光。上述結(jié)果表明這種夾心結(jié)構(gòu)的生物傳感器具有良好的特異性。

4 結(jié) 論

采用溶劑熱法合成了尺寸均勻的NaYF4∶Yb3+，Tm3+上轉(zhuǎn)換納米粒子，基于這種激發(fā)和發(fā)射均位于近紅外區(qū)域的發(fā)光探針構(gòu)建了固相生物傳感器，通過雙抗體夾心免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對溶液中IgG的檢測。該系統(tǒng)檢測限為1.82 nmol/L，并實(shí)現(xiàn)了5～400 nmol/L的寬范圍檢測，同時表現(xiàn)出了優(yōu)秀的檢測特異性。這一工作有望用于多種抗原抗體和DNA，為血液中疾病相關(guān)生物分子的快速靈敏檢測提供了一個具有廣闊前景的方法和平臺。