王瑞花，欒玉靜，董 穎，杜鴻雁，王愛華

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

東莨菪堿（Scopolamine）是一種莨菪烷型生物堿[1]，存在于茄科植物中，可用于麻醉鎮(zhèn)痛、止咳、平喘，對動(dòng)暈癥有效，具有鎮(zhèn)靜、致幻作用[2-3]。右美托咪定作為一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑[4-5]，擁有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗交感及呼吸抑制輕等特點(diǎn)[6]，鎮(zhèn)靜效應(yīng)呈自然睡眠樣[7]，是一種隨時(shí)可喚醒的鎮(zhèn)靜劑[8]，廣泛用于臨床麻醉。近年來用二者混合物實(shí)施麻醉搶劫、強(qiáng)奸、殺人的案件不斷增多。究其原因，筆者認(rèn)為右美托咪定可使人失去意識(shí)，中樞性差，東莨菪堿可以起到中樞鎮(zhèn)靜作用，二者合用具有很好的協(xié)同作用，更主要的是二者不被管制，容易獲得，且無色無味，放在飲料里很難被察覺?，F(xiàn)有的檢驗(yàn)方法僅限于單一藥物的檢驗(yàn)，主要有高效液相色譜方法[9-11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-16]、毛細(xì)管電泳法[17]等。因而，本文旨在建立一種同時(shí)檢測全血中東莨菪堿和右美托咪定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，以滿足刑事案件的檢驗(yàn)需求。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ACQUITY UPLCXevo TQ MS系統(tǒng)， Masslynx工作站( 美國Waters 公司) ，Milli-Q 純水系統(tǒng)( 美國Millipore 公司 )， BP210s 電子天平 (德國 Sartorius公司) ，東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品鑒定所，純度大于99.0%），右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)品（美國DrEhrebstorfer，99.0%），乙腈、甲酸銨為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取右美托咪定、東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別定容于10 mL的甲醇中，配置成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在4 ℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)需要，用乙腈逐級稀釋。

1.3 樣品的制備

取血液樣品1.0 mL，用4 mL 0.1 moL/L的鹽酸進(jìn)行稀釋，振蕩、離心（8000 r/min，20 min），上清液經(jīng)3 mL甲醇活化，3 mL水、0.1 moL/L的鹽酸潤洗過的Oasis MCX固相萃取柱，經(jīng)3 mL 0.1 moL/L的鹽酸、3 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液，離心甩干萃取柱，3 mL 2%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，50 ℃空氣流下?lián)]干，500 μL初始流動(dòng)相定容，過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，供LC-MS/MS分析。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱( 100 mm×2. 1 mm，1.7 μm) ，柱溫35 ℃。流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B： pH 9水溶液；洗脫方式：梯度洗脫，詳見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Gradient of mobile phase

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源( ESI) ，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式( MRM)，毛細(xì)管電壓1.0 kV，去溶劑溫度450 ℃，去溶劑氣流速1000 L/h。兩種物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 東莨菪堿和右美托咪定的檢測參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of scopolamine and dexmedetomidine

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的選擇

根據(jù)東莨菪堿和右美托咪定的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇電噴霧正離子電離模式，取200 ng/mL東莨菪堿、右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)溶液，以20 μL/min的速度直接進(jìn)樣，分別對噴霧電壓、毛細(xì)管溫度、霧化流速及溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，通過全掃描方式觀察，得到目標(biāo)化合物的準(zhǔn)分子離子。通過碰撞反應(yīng)進(jìn)行離子掃描，選擇豐度較大的兩個(gè)子離子作為定量離子和輔助定性離子，目標(biāo)物的質(zhì)譜條件見表2。

實(shí)驗(yàn)考察了在ACQUITY UPLC?HSS T3 、ACQUITY UPLC BEH C18兩種不同柱子和酸性（pH=3）堿性（pH=9）條件下不同流動(dòng)相對二者的分離效果。結(jié)果表明此兩款柱子均可達(dá)到對二者的分離，但在酸性條件下，東菪莨堿因溶劑效應(yīng)的影響，存在前拖尾現(xiàn)象，在ACQUITY UPLC BEH C18柱上堿性條件下分離，其效果好，靈敏度高、峰形對稱，分析結(jié)果見圖 1～3。

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，分析空白血樣，不受血液中基質(zhì)的干擾（見圖4），東莨菪堿和右美托咪定具有良好的色譜峰，保留時(shí)間分別為1.46 min 和1.89 min（見圖5）。表明本方法具有良好的專屬性。

圖1 BEH C18柱總離子流圖 ( pH=3)Fig.1 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=3)

圖2 HSS T3柱總離子流圖( pH=3)Fig.2 TIC chromatogram of HSS T3 (pH=3)

圖3 BEH C18柱總離子流圖(pH=9)Fig.3 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=9)

圖4 空白血MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of blank blood

圖5 空白血添加50ng標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of 50ng standard substance in blank blood

2.2 前處理方法的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了液液萃取、乙腈沉淀蛋白和固相萃取3種方法對兩種化合物的提取效果，表明東莨菪堿液液萃取提取回收率低，乙腈沉淀蛋白法簡單快速，但二者之間的回收率差異較大。針對固相萃取實(shí)驗(yàn)比較了Oasisò HLB與OasisòMCX兩種小柱，相關(guān)數(shù)據(jù)見表3，本實(shí)驗(yàn)最終選用萃取物干凈、萃取效果好的OasisòMCX柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表3 乙腈沉淀蛋白、液液提取和固相萃取的平均回收率Table 3 Average recovery rate of acetonitrile-precipitated protein, liquid-liquid extraction and solid phase extraction

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

毒物分析中最常用的基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)方法是提取后加入法。本實(shí)驗(yàn)測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜峰面積(S1) 和空白樣品基質(zhì)提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積(S2) ，以比值S2 /S1(%)來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)對四種提取方法的基質(zhì)效應(yīng)做了比較，結(jié)果顯示OasisòMCX萃取的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，血液中兩種藥物在10、50、100 ng /L 濃度時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)值均在87.1%～107.6%之間。

2.4 線性范圍和檢出限

血樣1.0 mL若干份，分別加入適量的東莨菪堿和右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)工作液，使二者在血液樣品中的濃度分別為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL，按照1.3的方法進(jìn)行提取，1.4的方法進(jìn)行分析，以濃度對定量離子的峰面積進(jìn)行線性回歸，得右美托咪定和東莨菪堿的回歸方程分別為：y= 710.33x+1652.4和y= 444.16x- 1087；二者均在1.0～200.0 ng/mL 線性范圍內(nèi)關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.9991和R2=0.9962。按信噪比（S/N）≥3，計(jì)算得血液中二者的檢出限均低于0.1 ng/mL。

2.5 回收率和精密度

取空白血液1.0 mL，配制東莨菪堿和右美托咪定高、中、低3個(gè)濃度（10、50、200 ng/mL）的血液樣，每一濃度平行5份，按照1.3和1.4項(xiàng)下的方法操作，每個(gè)濃度同日內(nèi)連續(xù)測定3次，根據(jù)目標(biāo)物特征離子峰面積計(jì)算回收率及日內(nèi)精密度，連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表4。

表4 血液樣本中東莨菪堿和右美托咪定的回收率及精密度（n=5）Table 4 Precision and recovery of scopolamine and dexmedetomidine in blood samples (n=5)

2.6 案例應(yīng)用

2016年8月8日，某市110指揮中心接警稱，某停車場一輛車內(nèi)發(fā)現(xiàn)一具男性尸體。送檢檢材為胃內(nèi)容及血，經(jīng)篩查，胃內(nèi)容中含有東莨菪堿和右美托咪定，采用本文方法，從血及胃內(nèi)容中均檢出右美托咪定和東莨菪堿，血中右美托咪定和東莨菪堿的含量分別為49.4 ng/mL和142.0 ng/mL。

3 結(jié)論

本文采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測東莨菪堿和右美托咪定，方法前處理簡單，使用有機(jī)溶劑少，降低了雜質(zhì)干擾，回收率高，靈敏度高，重現(xiàn)性好，定性、定量準(zhǔn)確。該方法有效提高了所涉及案件中東莨菪堿和右美托咪定檢測的專一性和靈敏度，為公安部門偵破此類案件提供了重要的技術(shù)支持。