金柯 謝絢 潘越江 王科喜 陳柏深 吳多光 沈卓堅 王銘輝 張惠忠

我國肺癌發(fā)病率高，國家癌癥中心2017年的統(tǒng)計報告顯示，全國惡性腫瘤發(fā)病第1位的是肺癌，每年新發(fā)病例約78.1萬，肺癌致死率高，我國每年約59.1萬人死于肺癌[1]。

近幾十年來，隨著對肺癌基因?qū)W及分子生物學(xué)研究的深入，出現(xiàn)了多種類型效果良好的靶向藥物[2]。這些靶向藥物主要針對EGFR、BRAF、HER2等點突變基因，F(xiàn)GFR、MET擴增以及ALK、ROS1、RET等重排基因變異[3,4]。靶向藥物對攜帶敏感突變基因的患者具有良好的抗腫瘤效果，因此，基因檢測在肺癌診斷與治療中的應(yīng)用越來越廣泛。

基因檢測方法多樣[5]，包括：一代測序（也稱為Sanger測序）、二代測序、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）等，qPCR又可分為普通探針、小溝結(jié)合（minor groove binder,MGB）探針、擴增阻礙突變系統(tǒng)（Amplification Refractory Mutation System,ARMS）-PCR等多種類型。突變位點特異擴增法（Amplification Mutation Specific System,AMSS）-PCR利用突變堿基及特殊修飾的TaqMan探針，使得突變型有熒光信號，而野生型沒有熒光信號。該方法僅用待檢樣本形成的檢測曲線，即可直觀判讀定性結(jié)果，最大限度地減少了誤判風(fēng)險。AMSS-PCR是一種新型的高敏感、高特異性的突變基因檢測方法。目前尚無研究報道該檢測方法在實際檢測中的效用。本研究通過對比Sanger測序、傳統(tǒng)ARMS-PCR以及AMSS-PCR在腫瘤突變基因檢測中的敏感性、特異性等指標，明確AMSS-PCR在肺癌突變基因檢測中的實用價值。

1 材料與方法

2017年1月-2018年5月間收集309例肺癌患者組織或體液標本，分別用試劑盒及一代測序進行突變基因檢測，并與患者前期所測Ct（cycle threshold）值的ARMSPCR結(jié)果進行比較。利用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，對不同檢測方法進行一致性Kappa檢驗，繪制分別以一代測序及ARMS-PCR為參照的試劑盒ROC，進一步明確試劑盒檢測的敏感性和特異性。

試劑盒：EGFR試劑盒（可檢測包括19DEL、L858R、T790M、20ins、C797S等在內(nèi)的大部分已知EGFR突變）；六聯(lián)試劑盒（可檢測KRAS、BRAF、ALK融合、ROS1融合、MET、HER2基因的主要突變）。

試劑盒采用AMSS-PCR，利用突變堿基及特殊修飾的Taqman探針，使得突變型有熒光信號，而野生型無熒光信號。

兩種試劑盒均來自上海桐樹生物科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況、標本類型、病理診斷 詳見表1。結(jié)果顯示，309例患者中男性196例，占63.43%；女性113例，占36.57%?；颊吣挲g范圍為23歲-84歲，中位年齡為63歲。所測基因突變306例來源于組織標本，液體標本共3例，其中2例為胸腔積液，1例為靜脈血。病理類型信息顯示，以非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）為主，占所有病理診斷的94.82%，其中肺鱗狀細胞癌占所有病理類型的23.30%，肺腺癌占70.23%。

2.2 測序結(jié)果 根據(jù)患者前期ARMS-PCR檢測結(jié)果，分別用EGFR試劑盒或六聯(lián)試劑盒驗證突變基因，同時進行一代測序，以便分析比較檢測結(jié)果。試劑盒與一代測序、ARMS-PCR檢測結(jié)果之間的符合率及詳細符合情況分別見表2、表3。結(jié)果顯示：試劑盒與一代測序及ARMSPCR有極高的符合率。兩種試劑盒比較，EGFR試劑盒與其他三種測序方法的符合情況優(yōu)于六聯(lián)試劑盒。試劑盒與一代測序符合情況優(yōu)于ARMS-PCR與一代測序。

2.3 三組檢測方法的一致性 對三組方法的檢測結(jié)果進行了一致性Kappa檢驗，結(jié)果顯示：兩種試劑盒與一代測序Kappa值為0.946，兩種試劑盒與ARMS-PCRKappa值為0.953，ARMS-PCR與一代測序Kappa值為0.913。Kappa值≥0.75顯示一致性良好，本研究中，三類檢驗方法一致性均良好。其中，試劑盒與一代測序及ARMS-PCR的一致性均優(yōu)于ARMS-PCR與一代測序的一致性。

2.4 試劑盒檢測的敏感性及特異性 分別以一代測序及ARMS-PCR為參照，繪制試劑盒受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）并計算曲線下面積（area under curve,AUC），結(jié)果見圖1。ROC曲線結(jié)果顯示：無論以作為金標準的一代測序，還是以敏感性較高ARMS-PCR為參照，試劑盒檢測均有極高的敏感性與特異性。ROC AUC≥0.9時，說明準確性高。本研究中，試劑盒與一代測序ROC的AUC為0.976，試劑盒與ARMS-PCR ROC的AUC為0.975，準確性良好。

3 討論

一代測序，又稱Sanger測序，1977年由FrederickSanger研發(fā)而成，是基于鏈終止的DNA測序方法。該方法以目標DNA單鏈為模板，在DNA多聚酶的催化下，合成新鏈，當熒光標記的雙脫氧核苷酸被選擇性地合成到新鏈上時，新鏈合成終止，從而得到一系列長度不等的DNA片段，再進行電泳，從而完成DNA測序[6]。迄今為止，Sanger測序仍然是基因測序的金標準，所有其他測序方法都以Sanger測序做參照。Sanger測序雖然是基因測序的金標準，但也有其局限性，包括：測序效率低，成本高，不能實現(xiàn)短時間內(nèi)完成大量測序。

表1 患者基本信息Tab 1 The baseline information of cases involved

表2 試劑盒與一代測序以及ARMS-PCR測序結(jié)果符合情況Tab 2 The comparison of detection results between assay panels and Sanger sequencing or ARMS-PCR

表3 ARMS-PCR與一代測序基因檢測結(jié)果符合情況Tab 3 The comparison of detection results between Sanger sequencing and ARMS-PCR

圖1 試劑盒檢測與一代測序及ARMS-PCR的ROC。A：以一代測序為參照的試劑盒ROC；B：以ARMS-PCR為參照的試劑盒ROC。Fig 1 ROC for detection results of assay panels referring to Sanger sequencing and ARMS-PCR.A:ROC of assay panels refer to Sanger sequencing(AUC:0.976);B:ROC of assay panels refer to ARMS-PCR (AUC:0.975).ROC:receiver operating characteristic curve.AUC:area under curve.

qPCR是利用PCR反應(yīng)檢測靶基因的一種檢測方法。該檢測需要加入靶基因特異性引物，檢測過程或摻入一種雙鏈DNA特異性染料，或利用5’-3’核酸外切酶釋放Taqman FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）探針。20世紀90年代初，qPCR技術(shù)迅速發(fā)展，利用該項技術(shù)可以進行基因分型、基因表達分析、拷貝數(shù)變異檢測以及病原體檢測等多方面檢測，因此，在臨床與研究機構(gòu)應(yīng)用廣泛[7-10]。qPCR因其高敏感性及特異性，被美國食品藥品管理監(jiān)督總局（Food and Drug Administration,FDA）批準為多種臨床基因檢測的金標準。李永文等[11]研究也證明，與一代測序相比，qPCR更適用于臨床檢測。

AMSS-PCR基于ARMS、MGB探針以及熒光PCR技術(shù)，實現(xiàn)樣本DNA和RNA中EGFR、KRAS、BRAF、HER2、MET、ALK、ROS1基因突變檢測。

ARMS又稱等位基因特異性擴增（alleles specific amplification,ASA）。利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設(shè)計等位基因特異性 PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴增帶，從而檢測出突變。ARMS-PCR是一種高敏感性、高特異性、低成本的突變檢測方法[12]。ARMS-PCR還有一個比較顯著的優(yōu)勢，就是該項檢測設(shè)計擴增的DNA片段比普通DNA片段長，不管突變狀態(tài)如何，突變位點兩側(cè)的共同區(qū)域都可以被擴增成獨立的片段。這些擴增出來的獨立片段是相同的，可用做DNA模板質(zhì)量內(nèi)參，對PCR反應(yīng)也有潛在的抑制作用[13]。

ARMS-PCR比直接測序有更高的敏感性。一般來說，直接測序需要標本中突變的腫瘤細胞數(shù)目占可檢測的所有腫瘤細胞數(shù)目的20%以上[14,15]，而ARMS-PCR因為使用特異性探針擴增相應(yīng)的突變序列，標本中突變的腫瘤細胞數(shù)目達可檢測的所有腫瘤細胞數(shù)目的1%即可檢測出突變[16]。ARMS-PCR的局限性在于，這種檢測方法只能用于已知突變的檢測，而如果已知突變占所檢測位點的絕大部分（如EGFR，已知常見突變占所有突變的95%以上）[17]，這一局限性就無足輕重了。

qPCR所用探針不同，檢測結(jié)果也有差異。Taqman探針兩端分別帶有熒光基團和熒光淬滅基團，在正常狀態(tài)下，探針上的熒光被淬滅，不發(fā)出熒光。開始進行PCR擴增后，探針被PCR酶水解，淬滅基團與熒光基團分離，熒光信號釋放出來，然后根據(jù)熒光信號強度確認PCR擴增合成的DNA的量。而MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團（non-fluorescent quencher），本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度[18]。同時，探針上還連接有MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10℃左右。因此，為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大幅提高，在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。

本研究中的試劑盒基于ARMS-PCR以及高效一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，依據(jù)引物和探針與突變位點的完全配對，抑制野生型模板的擴增，F(xiàn)AM熒光從而實現(xiàn)EGFR、KRAS、BRAF、HER2、MET、ALK、ROS1基因突變的實時檢測；另外每一突變檢測反應(yīng)管中還含有檢測人類基因保守區(qū)域的引物和HEX標記的熒光探針，作為內(nèi)控用于監(jiān)控樣本DNA和RNA有無正確加入和PCR擴增過程有無異常。本研究采用試劑盒檢測，突變型有熒光信號，野生型無熒光信號，與常規(guī)ARMS-PCR不同，無須通過Ct值大小確定檢測結(jié)果，只要擴增曲線有抬高，即認定為檢測結(jié)果陽性，降低了誤判風(fēng)險。

研究結(jié)果顯示，試劑盒與一代測序及測Ct值的ARMS-PCR的符合率高于ARMS-PCR與一代測序的符合率。兩種試劑盒比較，EGFR試劑盒與其他三種測序方法的符合情況優(yōu)于六聯(lián)試劑盒，考慮與六聯(lián)試劑盒所檢測的基因種類多，只能覆蓋各基因的主要突變類型有關(guān)。Kappa一致性檢驗及ROC結(jié)果顯示，試劑盒檢測的敏感性及特異性與一代測序及ARMS-PCR測序相當。

基于AMSS-PCR的試劑盒檢測方便、快捷，檢測結(jié)果可靠，與一代測序特異性相當，敏感性高于一代測序；與通過Ct值判定檢測結(jié)果的ARMS-PCR的敏感性相當，特異性優(yōu)于高敏感性檢測，是適合于臨床推廣的基因檢測方法。