呂曉燕 尹君婧 楊秀成 劉沙 孫考祥

據2015年中國癌癥統(tǒng)計顯示，非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌的85%，75%的患者發(fā)現時已處于中晚期，轉移后5年生存率低至17.1%[1]。傳統(tǒng)治療方案一般使用鉑類藥物進行化療，但治療的有效率僅為10%左右。2004年，研究發(fā)現，NSCLC與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變有關，自此肺癌的治療進入分子靶向研究階段。吉非替尼是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI），對EGFR突變的患者療效優(yōu)于化療[2]。但是患者在用藥一年后出現TKI耐藥，研究[3]表明這種TKI耐藥主要是由于EGFR外顯子的蘇氨酸-790突變?yōu)榈鞍彼幔═790M）。第二代不可逆EGFR酪氨酸激酶抑制劑-阿法替尼（afatinib）即是針對TKI繼發(fā)性耐藥開發(fā)研制的，它攜帶一個反應性的丙烯酰胺基，是ATP競爭苯胺基衍生物，能夠阻止EGFR、HER2和HER4激酶，形成共價鍵和不可逆價鍵。臨床研究表明阿法替尼與西妥昔單抗聯用對繼發(fā)性TKI耐藥產生明顯療效[3-5]。但目前市售阿法替尼為片劑，口服給藥生物利用度較低，且不良反應較多，其中胃腸道的不良反應和給藥部位異常較為常見，嚴重者需中斷給藥或減少劑量進行控制[6-10]。為提高患者的生命質量，更好的發(fā)揮藥效，開發(fā)一種具有靶向性、生物利用度高、不良反應少的阿法替尼新型制劑勢在必行。

本研究采用脂質體作為藥物載體，并在表面鏈接甲氧基聚乙二醇磷脂（DSPE-PEG2000），實現藥物在體內的長循環(huán)作用，提高生物利用度，減少藥物對胃腸道的刺激，降低不良反應的發(fā)生。脂質體的制備方法包括薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、有機溶劑注入法、梯度載藥法等，其中薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法和有機溶劑注入法為被動載藥，包封率相對較低；而梯度載藥法為主動載藥，包封率高。本研究先后采用薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、改良的乙醇注入法和硫酸銨梯度法制備脂質體，通過葡聚糖凝膠微柱離心純化脂質體，采用紫外分光光度法測定脂質體的包封率，用Nicomp 380 ZLS激光粒度儀測定脂質體的粒徑，進一步優(yōu)化處方工藝參數，以確定阿法替尼脂質體的最佳制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料 IKA旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA公司），DF-101Z集熱式恒溫磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司），電子分析天平（美國Mettler Toledo公司），JY92-II超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），Nicomp 380 ZLS激光粒度儀（美國PSS公司），離心機Primo R（美國SORVALL公司），UV-2450紫外分光光度儀（日本SHIMADZU公司）。阿法替尼雙馬來酸鹽（afatinib dimaleate）（武漢瑞立升科技發(fā)展有限公司，批號：20160615），高純氫化大豆磷脂（HSPC）（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號：B50337），膽固醇（CH）（上海緣聚生物科技有限公司），甲氧基聚乙二醇磷脂（DSPE-PEG2000）（煙臺芃碩生物科技有限公司，批號：C01126），硫酸銨（天津市致遠化學試劑有限公司），氯化鈉（天津市恒興化學試劑制造有限公司），葡聚糖凝膠G-50（華中海威基因科技有限公司），無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司），甲醇（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 制備工藝的選擇

1.2.1.1 薄膜分散法 取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按質量比4:1:1溶于適量的無水乙醇，旋轉蒸發(fā)儀減壓旋轉形成薄膜，加入適量阿法替尼溶液，65 ℃水化20 min，制得脂質體初品。經超聲細胞粉碎機200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通過0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔濾膜，即得阿法替尼脂質體。

1.2.1.2 逆向蒸發(fā)法 取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按質量比4:1:1溶于適量的無水乙醇，加入阿法替尼溶液，進行短時超聲，直至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑。減壓除去乙醇，經超聲細胞粉碎機200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通過0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔濾膜，即得阿法替尼脂質體。

1.2.1.3 改良的乙醇注入法 取膜材HSPC、CH、DSPEPEG2000按質量比4:1:1溶于適量的無水乙醇，加入預熱至相同溫度的阿法替尼溶液，65 ℃水浴攪拌20 min，經超聲細胞粉碎機200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通過0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔濾膜，即得阿法替尼脂質體。

1.2.1.4 硫酸銨梯度法 取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按質量比4:1:1溶于適量的無水乙醇，加入預熱至相同溫度的200 mmol/L的硫酸銨溶液，65 ℃水浴攪拌20 min，得空白脂質體初品。經超聲細胞粉碎機200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通過0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔濾膜，得空白脂質體混懸液。將制得的空白脂質體，常溫下透析除去脂質體外水相的硫酸銨。以藥脂質量比1:8向脂質體混懸液中加入一定體積阿法替尼溶液，60 ℃孵育10 min，即得阿法替尼脂質體。

1.2.2 阿法替尼含量的測定方法

1.2.2.1 最大吸收波長的選擇 配制一定濃度的阿法替尼甲醇溶液，取相應量不含阿法替尼的空白脂質體溶于甲醇中，以甲醇作為空白對照溶液，在200 nm-400 nm范圍內掃描，確定最大吸收波長。

1.2.2.2 標準溶液的制備 配制濃度為5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL的阿法替尼甲醇溶液，使用紫外分光光度儀，設定吸收波長343.6 nm，測定吸光度，以吸光度A對濃度C（μg/mL）繪制標準曲線。

1.2.2.3 精密度的考察 配制低、中、高（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL）3種濃度的阿法替尼甲醇溶液，同一天內連續(xù)測5次測定吸光度值，計算精密度。

1.2.2.4 重現性的考察 配制10 μg/mL的阿法替尼的甲醇溶液，連續(xù)測5次測定吸光度值，計算重現性。

1.2.2.5 方法回收率的考察 配制低、中、高（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL）三個濃度的阿法替尼甲醇溶液，測定吸光度值，并通過標準曲線計算濃度，此濃度與理論濃度相比計算得方法回收率。

1.2.3 脂質體的純化方法

1.2.3.1 葡聚糖凝膠G-50的預處理 取適量的葡聚糖凝膠G-50置于燒杯中，近沸水浴中加熱5 h左右，使凝膠充分溶脹。放涼后用超純水沖洗3遍，待用。

1.2.3.2 洗脫次數的選擇 取脂質體200 μL滴加到葡聚糖微柱的中心，停留2 min后，500 rpm離心5 min，用甲醇定容至5 mL。之后加超純水500 μL，1,500 rpm離心5 min，分次進行洗脫，每份洗脫液用甲醇定容至5 mL，于343.6 nm處測定每份洗脫液的吸光度。同法測定阿法替尼溶液的洗脫情況。

1.2.3.3 空白脂質體回收率的考察 取兩份空白脂質體200 μL，一份直接用甲醇定容至10 mL，測吸光度為A0。一份上樣于葡聚糖凝膠微柱，停留2 min后，500 rpm離心5 min。加超純水500 μL，1,500 rpm離心5 min，重復洗脫2次。合并洗脫液，用甲醇定容至10 mL，測吸光度為A1。通過標準曲線計算C0、C1，回收率公式為R=（C1/ C0）×100%。

1.2.4 不同制備工藝脂質體包封率和粒徑的測定 對不同工藝制備的脂質體包封率進行測定，用Nicomp 380 ZLS激光粒度儀對脂質體的粒徑進行測定，在透射電鏡下觀察其形態(tài)，并對最佳制備工藝所制得的脂質體的載藥量進行計算。

載藥量（loading efficiency）是指單位重量或單位體積脂質體所負載的藥量，LE（%）=We/Wm×100%，式中LE表示脂質體中藥物的載藥量百分數；We表示包封于脂質體內的藥量；Wm表示載藥脂質體的總重量。

1.2.5 單因素考察 通過對制備工藝的分析，本研究對HSPC與CH的質量比、afatinib與HSPC的質量比、硫酸銨的濃度、孵育溫度與孵育時間等因素進行考察。在其他參數保持不變的條件下，只改變單一因素，以粒徑和包封率為指標，考察該因素對脂質體制備工藝的影響。

1.2.5.1 HSPC與CH的質量比對脂質體的影響 在不改變其他因素的條件下，分別考察了HSPC與CH的質量比為2:1、4:1和6:1時對脂質體的包封率和粒徑的影響。

1.2.5.2 Afatinib與HSPC的質量比對脂質體的影響 在不改變其他因素的條件下，分別考察了afatinib與HSPC的質量比為1:4、1:8和1:16時對脂質體的包封率和粒徑的影響。

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1.2.5.3 硫酸銨的濃度對脂質體的影響 在不改變其他因素的條件下，分別考察了硫酸銨的濃度為150 mmol/L、200 mmol/L和250 mmol/L時對脂質體的包封率和粒徑的影響。

1.2.5.4 孵育溫度對脂質體的影響 在不改變其他因素的條件下，分別考察了孵育溫度為50 ℃、60 ℃和70 ℃時對脂質體的包封率和粒徑的影響。

1.2.5.5 孵育時間對脂質體的影響 在不改變其他因素的條件下，分別考察了孵育時間為5 min、10 min和15 min時對脂質體的包封率和粒徑的影響。

2 結果

2.1 制備工藝的選擇 采用薄膜分散法制得的脂質體，外觀較混濁，不易過膜；采用逆向蒸發(fā)法制得的脂質體，外觀半透明，略帶藍色乳光，較易過膜；采用改良的乙醇注入法制得的脂質體，外觀半透明，略帶藍色乳光，較易過膜；采用硫酸銨梯度法制得脂質體，外觀半透明，略帶藍色乳光，易過膜。

2.2 阿法替尼含量的測定方法

2.2.1 最大吸收波長的選擇 阿法替尼溶液在1、2、3處均有吸收（圖1），但因在第2處波長下脂質體膜材的干擾較大，第3處已接近近紫外端，故選擇第1處——343.6 nm為最大吸收波長。

2.2.2 標準溶液的制備 計算吸光度A對濃度C的回歸方程為y=0.027,2x+0.003,6，R2=0.999,4（圖2），結果表明，在濃度范圍為5 μg/mL-25 μg/mL時，標準曲線的線性良好。

2.2.3 精密度的考察 經測定，阿法替尼溶液低、中、高三種濃度的RSD值均小于1%（表1），結果表明方法的精密度良好。

2.2.4 重現性的考察 連續(xù)測定5次，阿法替尼溶液（10 μg/mL）的RSD值均小于1%（表2），結果表明方法的重現性良好。

2.2.5 方法回收率的考察 經測定，方法的回收率在99.74%-101.68%之間（表3），結果表明方法的回收率良好。

2.3 脂質體的純化方法

2.3.1 洗脫次數的選擇 實驗結果表明，用超純水洗脫兩次時脂質體已洗脫99.17%（表4），而此時阿法替尼溶液不被洗脫，因此選擇洗脫兩次純化脂質體。

2.3.2 空白脂質體回收率的考察 經計算，空白脂質體的回收率R為99.3%，表明葡聚糖凝膠微柱在此洗脫條件下對空白脂質體幾乎沒有吸附。

表1 阿法替尼溶液精密度測定結果（n=5）Tab 1 The precision results of afatinib solution (n=5)

表2 阿法替尼溶液重現性測定結果（n=5）Tab 2 The reproducibility results of afatinib solution (n=5)

圖1 紫外最大吸收波長掃描圖。A：阿法替尼；B：空白脂質體。Fig 1 The maximum absorption wavelength scanning of ultraviolet light.A:Afatinib; B:Blank liposomes.

圖2 阿法替尼溶液標準曲線Fig 2 Standard curve of afatinib solution

2.4 包封率方法的確立 取脂質體200 μL滴加到葡聚糖微柱中心，停留2 min后，500 rpm離心5 min。隨后加超純水500 μL，1,500 rpm離心5 min，重復洗脫2次。合并洗脫液，用甲醇定容至10 mL，測吸光度為A1。取脂質體200 μL，直接用甲醇定容至10 mL，測吸光度為A0。通過標準曲線計算C1、C0，包封率根據公式EE=（C1/C0）×100%計算。

2.5 不同制備工藝脂質體包封率和粒徑的測定 采用建立的包封率測定方法對四種不同制備工藝的脂質體進行測定，結果表明硫酸銨梯度法的包封率最高，為90.73%（表5），平均粒徑為108.6 nm（圖3）。經透射電鏡觀測，脂質體呈球形，形態(tài)規(guī)則完整，可觀察到雙層膜結構，粒徑分布均勻（圖4），因此選擇硫酸銨梯度法來制備阿法替尼脂質體。計算用硫酸銨梯度法制備的脂質體的平均載藥量為7.52%。

圖3 硫酸銨梯度法制備脂質體粒徑分布（粒徑：108.6 nm，P.I.：0.154）Fig 3 Particle size distribution of liposomes prepared by ammonium sulfate gradient method (particle size:108.6 nm,P.I.:0.154)

圖4 硫酸銨梯度法制備脂質體透射電鏡照片。A：0.5 μm；B：0.2 μm。Fig 4 Transmission electron micrograph of liposomes prepared using ammonium sulfate gradient method.A:0.5 μm; B:0.2 μm.

表3 阿法替尼溶液方法回收率結果（n=5）Tab 3 Theresults of recovery experiments of afatinib solution (n=5)

表4 不同洗次數對脂質體和阿法替尼溶液洗脫結果影響（n=3）Tab 4 Effect of different elution times on the results of liposomes and afatinib solution (n=3)

2.6 單因素考察 當HSPC與CH的比例為4:1（表6），afatinib與HSPC的比例為1:8（表7），硫酸銨的濃度為250 mmol/L（表8），孵育溫度為60 ℃（表9），孵育時間為10 min（表10）時，脂質體的包封率高，粒徑小。因此，最終確定脂質體的制備工藝為：取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按質量比4:1:1溶于適量的無水乙醇中，于65 ℃水浴中加熱溶解，加入預熱至相同溫度的250 mmol/L的硫酸銨溶液，65 ℃水浴攪拌20 min，得空白脂質體初品。經超聲細胞粉碎機200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通過0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔濾膜，得空白脂質體混懸液。將制得的空白脂質體常溫下透析，除去脂質體外水相的硫酸銨。以藥脂比1:8向此梯度脂質體混懸液中加入一定體積的阿法替尼溶液，60 ℃孵育10 min。即得阿法替尼脂質體。

3 討論

脂質體的制備方法包括薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、有機溶劑注入法、梯度載藥法等，其中薄膜分散法多用于脂溶性藥物的包載，其成膜的均勻性較為關鍵，所制得的脂質體粒徑較大；逆向蒸發(fā)法適于包封水溶性的藥物，制得的脂質體內水相較大且包封率較高；有機溶劑注入法操作簡單，尤其是乙醇注入法可以避免高毒性的有機溶劑殘留問題，在近年的放大生產研究中較為常用；而梯度載藥法為主動載藥的制備方法，適用于水溶性藥物的包載，制得的脂質體包封率高。本研究先后采用薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、改良的乙醇注入法和硫酸銨梯度法來制備脂質體，通過對比4種制備方法的包封率和粒徑，最終確定制備阿法替尼脂質體的最優(yōu)工藝為硫酸銨梯度法。硫酸銨梯度法屬于梯度載藥法的一種，其方法是先制備空白脂質體，在空白脂質體內外形成離子梯度，水溶性的阿法替尼雙馬來酸鹽在離子梯度的作用下進入空白脂質體，并在脂質體內與硫酸銨形成溶解度較小的鹽，使藥物滯留在脂質體內，此方法制得的脂質體包封率高，粒徑小。

常用的脂質體純化的方法有柱過濾法、超濾法、離心法等。本研究先后考察葡聚糖凝膠過濾法、超濾法、陽離子交換樹脂法和葡聚糖微柱離心法。葡聚糖凝膠過濾法雖然可以達到分離的效果，但是操作繁瑣，耗時較長，不易操作；超濾法所用的超濾管的膜材對阿法替尼有吸附作用，不能有效地純化脂質體，導致包封率測定不準確；陽離子交換樹脂法，操作簡單，因阿法替尼的理化性質，游離藥物可完全吸附于微柱上，但是陽離子交換樹脂為黃色，雖預處理時已洗凈至肉眼觀察為無色，但其對測定仍有干擾，所測包封率偏高；而葡聚糖微柱離心法，操作簡單，能有效地純化脂質體，經驗證后選定為脂質體純化的方法。

表5 不同工藝對脂質體包封率和粒徑影響（n=3）Tab 5 Effect of different process on encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表6 HSPC與CH比例對脂質體包封率和粒徑的影響（n=3）Tab 6 Effect of the ratio of HSPC and CH on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表7 Afatinib與HSPC比例對脂質體包封率和粒徑的影響（n=3）Tab 7 Effect of the ratio of afatinib to HSPC on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表8 硫酸銨濃度對脂質體包封率和粒徑的影響（n=3）Tab 8 Effect of ammonium sulfate concentration on liposomes encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表9 孵育溫度對脂質體包封率和粒徑的影響（n=3）Tab 9 Effect of incubation temperature on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表10 孵育時間對脂質體包封率和粒徑的影響（n=3）Tab 10 Effect of incubation time on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

常用的測定藥物含量的方法有：紫外分光光度法和高效液相色譜法等。高效液相色譜法測定準確，但是操作繁瑣，進樣前需再次過濾樣品，并需充分平衡色譜柱；紫外分光光度法操作簡便，測樣時間短，經驗證可滿足樣品測定所需條件，故選用紫外分光光度法作為測定包封率的方法。

本研究采用硫酸銨梯度法成功制備阿法替尼脂質體，并通過葡聚糖微柱離心純化脂質體，利用紫外分光光度法測定包封率，操作簡單，可重復性好。本研究為阿法替尼的給藥方式提供了新的思路，在減輕患者的不良反應方面做出了努力，為阿法替尼的廣泛應用打下了基礎。