劉小琴 舒華娥 肖 行 陳 西 馬 遙

白血病干細(xì)胞(leukemic stem cell,LSC)的存在是白血病難治復(fù)發(fā)的根源，也解釋了臨床上白血病治療的難點和疑惑[1]。LSC具有很強(qiáng)的生存優(yōu)勢，對化療藥物耐藥[2]。近年來越來越多研究證據(jù)表明，白血病復(fù)發(fā)和耐藥的根本原因是LSC的存在，多信號系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致其對多種化療藥物如柔紅霉素耐藥是治療失敗和復(fù)發(fā)的分子基礎(chǔ)[3]。在誘導(dǎo)增敏殺傷概念指導(dǎo)下，采用植物多酚調(diào)節(jié)凋亡信號通路誘導(dǎo)凋亡和提高其對化療藥物(柔紅霉素)敏感性的“自亡和它殺”相結(jié)合的新方法，有望達(dá)到最大限度清除天然耐藥的LSC目的[4]。本研究以人急性髓系白血病KG1a細(xì)胞株中獲得的CD34+CD38-LSC為靶細(xì)胞，通過柔紅霉素干預(yù)發(fā)生耐藥后，再采用植物多酚干預(yù)耐藥的LSC，以增殖抑制率、遷移侵襲能力、凋亡率、內(nèi)/外源性凋亡通路中關(guān)鍵分子變化為指標(biāo)，評價植物多酚增強(qiáng)柔紅霉素耐藥的LSC的敏感性的生物學(xué)效應(yīng)，并探明相關(guān)的分子機(jī)制，為有效清除LSC提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：人急性髓系白血病KG1a細(xì)胞株(南京森貝伽生物科技有限公司，中國)；PCR試劑盒(上海碩盟生物，中國)，MTT試劑盒(北京中杉金橋生物公司，中國)，不含血清培養(yǎng)基、含血清的完全培養(yǎng)基(GIBCO公司，USA)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(武漢博士德，中國)，Transwell 24孔培養(yǎng)板(Corning 公司，USA)，凋亡相關(guān)基因Bax(Santa Cruz公司)。96孔板、10 cm2培養(yǎng)皿(Corning 公司，USA)，含EDTA的胰酶(GIBCO公司，USA)。儀器：80 ℃～4 ℃冰箱(日本松下)，高轉(zhuǎn)速冷凍離心機(jī)(BiofugeStratos，德國)，培養(yǎng)箱(Queue systems，USA)，細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(蘇州凈化，中國)，F(xiàn)ACSort流式細(xì)胞儀(BD公司，USA)，倒置相差顯微鏡(奧林巴斯，日本)，PCR儀(Rotor-gene，澳大利亞)-高壓消毒箱(美國Tuttnauer，美國)。

1.2 免疫磁珠分選CD34+CD38-白血病干細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

將計數(shù)后的KG1a細(xì)胞重懸于PBS中，加入抗人CD38磁珠結(jié)合的單克隆抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，上機(jī)，陰性分選出CD38-的細(xì)胞，重新計數(shù)重懸于PBS中，加入抗人CD34和CD123磁珠結(jié)合的單克隆抗體，4 ℃ 孵育15 min，PBS洗滌2次，陽性分選選出CD34+CD38-的細(xì)胞，即為CD34+CD38-白血病干細(xì)胞。

將分選的CD34+CD38-LSC置于含雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃條件下于5% CO2孵箱中傳代。傳代條件為當(dāng)密度達(dá)到4×106時，以含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行再次接種。終止消化的條件為在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮時，此時加入含血清培養(yǎng)基，10 000 r/min離心5 min，棄上清，取細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)接種至新培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞干預(yù)

向呈對數(shù)生長的細(xì)胞加入1 μg/mL柔紅霉素干預(yù)，細(xì)胞增殖從緩慢變迅速，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4×106，出現(xiàn)耐藥的情況下給予植物多酚刺激，對照組不接受相應(yīng)刺激，并予濃度為12.5 μg/ml的凋亡相關(guān)基因Bax刺激14 h收集細(xì)胞。

1.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

取實驗組及對照組細(xì)胞定量100 mg，提總RNA。逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)過程按照標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR進(jìn)行。Caspase-3、Caspase-9的引物：變性-梯度變性進(jìn)行30次的循環(huán)。得到的PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并行凝膠成像。內(nèi)參選擇18 s RNA，對半定量結(jié)果進(jìn)行比對，分析吸光度。

1.5 細(xì)胞凋亡與凋亡周期檢測

以Annexin V/PI法檢測，待細(xì)胞冷卻至4 ℃，洗滌，并使?jié)舛日{(diào)整為106/ml，加入PI與Annexin V-FITC，避光15 min后行流式檢測。

對收集的細(xì)胞加入Annexin V-FITC，采用API的方法檢測細(xì)胞的凋亡周期，靜置1 h之后進(jìn)行流式檢測。

雙標(biāo)流式細(xì)胞儀CyclinE/DNA分析周期特異性，處理好的細(xì)胞加入PI和RnaseA行DNA染色后行流式檢測。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞活力

將細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%，予植物多酚10 μl，植物多酚NC。48 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀560 nm處測OD值，細(xì)胞相對活力(%)=(實驗組OD/對照組OD值)×100%。

1.7 Transwell體外遷移體系

血清饑餓12 h，離心收集細(xì)胞，將Transwell培養(yǎng)池放入培養(yǎng)板中，加入細(xì)胞懸液(約5×104細(xì)胞)，含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察。1%十二烷基硫酸鈉(SDS)500 μl溶解細(xì)胞30 min。100 μl細(xì)胞裂解液，放入細(xì)胞培養(yǎng)板中，酶標(biāo)儀測定吸光值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 鑒定加入植物多酚干預(yù)的白血病干細(xì)胞的細(xì)胞周期

以植物多酚刺激柔紅霉素耐藥的白血病干細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖的情況：處于靜止期的白血病干細(xì)胞加入植物多酚后進(jìn)入G2～M期。

2.2 應(yīng)用API的方法檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期特異性分析

植物多酚誘導(dǎo)柔紅霉素耐藥的白血病干細(xì)胞，在G1期發(fā)生細(xì)胞凋亡，而對照組幾乎未發(fā)生細(xì)胞凋亡。

2.3 雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)CyclinE/DNA對細(xì)胞周期分析

植物多酚刺激之后出現(xiàn)在G0、早/晚G1、S2、G2、M期，白血病干細(xì)胞處在G0期，加入植物多酚誘導(dǎo)柔紅霉素耐藥的細(xì)胞阻滯在G1期，CyclinE表達(dá)下降。

2.4 Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響

植物多酚組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)均較對照組高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著時間的延長，植物多酚組誘導(dǎo)柔紅霉素耐藥的細(xì)胞凋亡指數(shù)呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，表2。

表1 Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)比較分析

表2 不同時相血清細(xì)胞凋亡指數(shù)變化

注：①為與3 h比較，P<0.05。

2.5 植物多酚對白血病干細(xì)胞活力的影響

與對照組[(90.48±8.67)%]比較，植物多酚組中柔紅霉素耐藥的白血病干細(xì)胞活力[(52.39±5.96)%]顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 白血病干細(xì)胞體外遷移能力

Transwell體外遷移實驗結(jié)果顯示，經(jīng)植物多酚作用后的耐藥白血病干細(xì)胞體外遷移的能力明顯降低(P<0.05)。第7天，對照組體外遷移細(xì)胞數(shù)目明顯高于植物多酚組(P<0.05)，見表3。

表3 白血病干細(xì)胞體外遷移細(xì)胞數(shù)目

注:①為與0天比較，P<0.05。

3 討論

白血病是一種常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國為4.17/10萬[5]。近年來，損傷性污染漸漸嚴(yán)重，由此引起的白血病發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，由于病因尚不明確，治療難度大[6]。目前白血病的治療仍以化療為主。盡管隨著臨床新藥的發(fā)展和聯(lián)合化療的應(yīng)用，白血病的緩解率顯著上升，但在復(fù)發(fā)/難治白血病仍未取得突破性進(jìn)展[4]。近年來越來越多研究證據(jù)表明，耐藥的根本原因是白血病干細(xì)胞的存在[7-8]。白血病干細(xì)胞失去正常的增殖分化能力，在多基因和多個信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)上發(fā)生異常，具有很強(qiáng)的無控性自主增殖能力。白血病干細(xì)胞具有特定的自我更新和增殖能力，通常處于G0期[9]，當(dāng)周圍環(huán)境改變時，能實現(xiàn)腫瘤的細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及浸潤，出現(xiàn)大量、快速地增殖，并使肝、脾、淋巴結(jié)腫大。

白血病干細(xì)胞對放射、藥物和自身免疫細(xì)胞的殺傷產(chǎn)生強(qiáng)大的抵抗力，內(nèi)外凋亡途徑發(fā)生異常改變[10]。這種在基因水平上的突變和調(diào)節(jié)信號的改變導(dǎo)致了對人體致死劑量水平藥物的耐受和抵抗，可從放療和化療過程獲得的，也可以是固有的。近30年來，白血病的治療發(fā)展進(jìn)入相對遲滯的平臺期，相當(dāng)數(shù)量的病例對當(dāng)前臨床主流的藥物缺乏敏感性，使其遠(yuǎn)期生存率難以得到顯著上升，探索有效、新的化療相關(guān)藥物就顯得尤為重要。當(dāng)細(xì)胞被阻滯在細(xì)胞周期中某一個時相時就會出現(xiàn)凋亡，周期性是細(xì)胞凋亡的特性，因而多數(shù)的腫瘤化療殺傷腫瘤細(xì)胞，是采用該理論誘導(dǎo)細(xì)胞在特定的周期內(nèi)發(fā)生凋亡[11]。

近來研究發(fā)現(xiàn)，來源于植物的小分子物質(zhì)，能作用于內(nèi)、外源性凋亡途徑的多個靶點，改變腫瘤細(xì)胞周期，還引起多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長[12]。植物多酚組是一大類具有不同結(jié)構(gòu)的化合物，癌癥低發(fā)與富含植物多酚的食用性植物關(guān)系密切[13]。動物實驗顯示植物多酚組能有效地抑制腫瘤誘發(fā)、促進(jìn)和發(fā)展多個階段，對化學(xué)誘發(fā)的腫瘤具有抗癌作用[14]。提高化療藥物劑量既不能很好消滅LSC，又帶來較大的副作用，且靶向分子藥物和傳統(tǒng)增敏藥物也不能很好增強(qiáng)LSC對化療藥物的反應(yīng)，因此需要尋找一種新方法，聯(lián)合應(yīng)用植物多酚啟動內(nèi)外凋亡途徑，作用于LSC凋亡通路多個靶點，增強(qiáng)其對化療藥物敏感性，誘導(dǎo)LSC凋亡，以期最大限度殺滅白血病干細(xì)胞[15]。

本研究以API法檢測植物多酚對柔紅霉素耐藥的LSC細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)情況，以及細(xì)胞凋亡的周期特異性。通過細(xì)胞核染色，顯示了早期細(xì)胞凋亡出現(xiàn)伴隨著膜外翻的現(xiàn)象。研究結(jié)果顯示，細(xì)胞的周期蛋白是一類在細(xì)胞周期中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，細(xì)胞周期的G1期是植物多酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與周期特異性凋亡的主要時相。刺激細(xì)胞周期的依賴性蛋白激酶可以表現(xiàn)細(xì)胞的特異性周期，CyclinE/DNA雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)通過對細(xì)胞所處的位置與細(xì)胞CyclinE的表達(dá)相結(jié)合實現(xiàn)對細(xì)胞周期的分析。周期蛋白最大的特點就是時相性，能夠獲得詳細(xì)的細(xì)胞周期信息。G1期是CyclinE的完全合成期，其中表達(dá)最強(qiáng)時是在G1晚期，且CyclinE不會出現(xiàn)在G0期，可見CyclinE能夠?qū)0與G1期進(jìn)行完全分開。本研究顯示細(xì)胞在G1期被阻滯，植物多酚誘導(dǎo)后的白血病干細(xì)胞CyclinE的表達(dá)是下降的，且伴隨著凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9的高表達(dá)；Transwell示，第7天植物多酚組體外遷移能力明顯降低；植物多酚組細(xì)胞活力下降。

綜上所述，白血病干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期后細(xì)胞凋亡才會變得敏感，在靜止期的時候并沒有啟動周期進(jìn)程，植物多酚誘導(dǎo)凋亡與柔紅霉素耐藥的白血病干細(xì)胞的細(xì)胞周期時相有密切關(guān)系，其可抑制細(xì)胞活性及遷移侵襲能力。