喬佳明 張芝晴 張振勇 李少偉 夏寧邵 顧 穎

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門 361102)

人CD4分子是一種單鏈跨膜蛋白，其胞外區(qū)具有4個(gè)Ig樣的結(jié)構(gòu)域，其中遠(yuǎn)端能夠與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(Major histocompatibility complexclass Ⅱ,MHCⅡ)類分子結(jié)合，胞質(zhì)區(qū)可以結(jié)合酪氨酸蛋白激酶p56lck，在部分T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞等表面均有表達(dá)[1]。作為細(xì)胞表面受體，其在細(xì)胞之間、細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)分子的相互作用起著十分關(guān)鍵的作用。

CD4分子具有重要的免疫學(xué)功能，它能夠參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。當(dāng)抗原侵入機(jī)體以后，在細(xì)胞免疫反應(yīng)中，會(huì)被抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell,APC)識(shí)別并加工處理，然后以MHCⅡ-抗原肽復(fù)合物的形式提呈給CD4+T細(xì)胞識(shí)別，其中CD4分子起到輔助受體的作用，其識(shí)別的是MHCⅡ分子的非多態(tài)區(qū)[2]。在體液免疫反應(yīng)中，抗原經(jīng)APC遞呈給CD4+輔助性T細(xì)胞，活化B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，部分B細(xì)胞分化成為記憶性B細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體受二次感染時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生抗體抵抗抗原。因此，CD4分子在機(jī)體正常的免疫功能中起著重要作用，CD4分子也成為許多疾病治療的重要靶標(biāo)[3]。

另外，在HIV-1感染過程中，CD4作為首要的受體，起到了至關(guān)重要的作用。成熟的CD4分子與HIV-1表面的包膜糖蛋白gp120結(jié)合，然后引起包膜蛋白構(gòu)象變化，進(jìn)而與胞外的輔助受體CCR5或者CXCR4結(jié)合，這樣拉近了病毒與細(xì)胞距離，從而二者之間發(fā)生膜融合，進(jìn)而病毒成功感染細(xì)胞[4-8]。因此，抑制HIV與CD4+細(xì)胞的結(jié)合成為HIV藥物治療的熱點(diǎn)之一。

CD4分子的不同功能，使其在各方面有了廣泛的應(yīng)用。最常見的是CD4胞外區(qū)與Fc融合形成融合蛋白，使得重組蛋白具有更長的半衰期，更適合于體內(nèi)應(yīng)用。例如Fc具有穿過胎盤、結(jié)合補(bǔ)體，還可以介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性等。另外，將CD4與某些靶向分子融合，靶分子在CD4的介導(dǎo)下與靶細(xì)胞等目標(biāo)物相結(jié)合，發(fā)揮靶向分子的治療效果[9,10]。此外，CD4抗體也被廣泛應(yīng)用，其中TNX-355、cM-T412、OKT4在某些疾病的臨床治療中已發(fā)揮了重要作用[11]。大量的研究通過不同的表達(dá)系統(tǒng)，如原核表達(dá)系統(tǒng)、真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等來表達(dá)可溶性的CD4(只包括胞外區(qū)，不包括疏水穿膜區(qū))[12]，制備CD4融合蛋白藥物或抗CD4的抗體等運(yùn)用于AIDS等其他相關(guān)疾病的研究[13,14]。但是這些表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化方法一般都太復(fù)雜，且存在一些如原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾系統(tǒng)不完善等問題。

本研究將全長CD4胞外區(qū)基因構(gòu)建于桿狀病毒表達(dá)載體，利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行CD4胞外區(qū)蛋白的表達(dá)，通過鎳柱純化即可獲得高純度的CD4蛋白，并對(duì)其抗原性與免疫原進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其具有較好的生物學(xué)活性，這為 HIV受體和感染的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 表達(dá)載體pAcgp67B由本實(shí)驗(yàn)室保存和構(gòu)建；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；昆蟲細(xì)胞Sf9和High Five購自Invitrogen公司；單抗15A7由本實(shí)驗(yàn)室制備； HIV-1感染性克隆NL4-3由朱樺教授饋贈(zèng)，相應(yīng)的病毒由本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)保存；BALB/c雌鼠(6周齡)購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2工具酶、生化試劑及純化介質(zhì) 核酸相關(guān)工具酶購自TaKaRa公司；Gibson組裝液由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；轉(zhuǎn)染試劑Cell Fectin Reagent購自Invitrogen公司；昆蟲培養(yǎng)基購自Expression systems公司；ELISA顯色液等材料購自北京萬泰公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自TianGen；相關(guān)引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Ni-NTA介質(zhì)購自GE Healthcare公司。

1.2方法

1.2.1人重組CD4胞外區(qū)蛋白的構(gòu)建與表達(dá)純化 利用本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的pAcgp67B表達(dá)載體，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(上游引物：pAc-CD4-F:5′-CATTCTGCCTTTGCGGCGGATCCCATGAAGAAAGTGGTGCT-GGGC-3′和下游引物：pAc-CD4-R:5′-TCAGATCTGCAGGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCA-TGTGGGCAGAACCTTGAT-3′)將CD4序列構(gòu)建到重組質(zhì)粒pAc-CD4中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增。然后將重組質(zhì)粒和線性桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染至由無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Sf9昆蟲細(xì)胞中，12 h后更換有血清的培養(yǎng)基，即可獲得重組桿狀病毒。再之后經(jīng)過10 cm細(xì)胞板、500 ml錐形瓶的擴(kuò)大培養(yǎng)，即可獲得大量的重組桿狀病毒。再利用現(xiàn)有的病毒感染High Five昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)72 h到96 h后收獲細(xì)胞上清，通過30 kD的膜包進(jìn)行濃縮，濃縮后上清經(jīng)10 000 r/min離心去除沉淀，上清經(jīng)Ni-NTA介質(zhì)進(jìn)行目的蛋白的純化，50 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，250 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，最后將目的蛋白透析于PBS中保存。

1.2.2人重組CD4胞外區(qū)蛋白的活性與均一性鑒定

1.2.2.1蛋白均一性檢測(cè) 將純化獲得的人重組CD4胞外區(qū)蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離鑒定，并用考馬斯亮藍(lán)染液染色觀察其組分均一性。同時(shí)通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用封閉液-1于4℃封閉10 h到12 h，再用一抗15A7室溫孵育1 h，之后用洗液漂洗3次，每次5 min，二抗使用GAM-HRP室溫孵育1 h，同樣漂洗3次后，顯色曝光拍照。

利用分子篩檢測(cè)蛋白在溶液中的均一性：將樣品以0.5 ml/min的流速通過G3000，記錄蛋白樣品不同組分的出峰情況。

1.2.2.2ELISA檢測(cè)活性 將純化獲得的蛋白以100 ng的量包被于ELISA檢測(cè)板上，之后將單抗15A7以首孔10 μg/ml的濃度3倍稀釋12個(gè)梯度，37℃孵育1 h后，用洗液洗板5次后甩干，再加入GAM-HRP二抗，37℃孵育1 h后洗板甩干。加入顯色液A液和B液37℃放置10 min進(jìn)行顯色，0.2 mmol/L濃硫酸終止顯色反應(yīng)。然后置于雙波長(450 nm和630 nm)讀板儀下讀取OD值，并用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)作圖。

將本實(shí)驗(yàn)室制備保存的HIV gp120蛋白以200 ng的量包被于ELISA檢測(cè)板上，再將標(biāo)記了生物素的CD4蛋白以首孔10 μg/ml的濃度3倍稀釋12個(gè)梯度，步驟同上，加入SA-HPR后，顯色終止。然后置于雙波長(450 nm和630 nm)讀板儀下讀取OD值，并用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)作圖。

將CD4蛋白以首孔20 μg/ml的濃度3倍梯度稀釋，再與HIV-1病毒進(jìn)行孵育1 h，然后感染Tzmb1細(xì)胞。48 h后固定細(xì)胞，顯色，利用Elispot讀板數(shù)點(diǎn)。

1.2.3SPR法測(cè)定CD4與15A7結(jié)合活性 首先，偶聯(lián) GAM 至CM5：用 70%的甘油 Normalize CM5芯片2次，Prime 1次后以HBS-EP為緩沖液，以5 μl/min的速率用 80 μl EDC/NHS 活化芯片4個(gè)通道，根據(jù)預(yù)結(jié)合確定的濃度與pH將GAM偶聯(lián)至芯片4個(gè)通道(GAM 60 μg/mL，稀釋于20 mmol/L pH5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液，用量80 μl)，用80 μl的乙醇胺封閉芯片。最后用 pH2.2～2.6的20 mmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液洗以30 μl/min 的流速再生3次，每次再生5 μl，把結(jié)合不牢固的GAM-Fc 和乙醇胺洗下來。其次，摸索適當(dāng)?shù)膯慰節(jié)舛?、上樣速率、上樣量等使響?yīng)值在合理范圍。本研究所使用的單抗上樣流速為30 μl/min，上樣時(shí)間為3.7 min。最后，進(jìn)行待測(cè)樣品抗原性檢測(cè)，通過編寫程序讓Biacore3000自動(dòng)上樣。

1.2.4人重組CD4胞外區(qū)蛋白免疫原性評(píng)價(jià)

1.2.4.1BALB/c小鼠免疫 取6周齡BALB/c小鼠4只，采集眼球后靜脈血，留作陰性對(duì)照血清使用。免疫原與弗氏佐劑混合乳化均勻，采取少量多點(diǎn)皮下注射免疫。初次免疫使用完全弗氏佐劑，免疫劑量為200 μg/只，加強(qiáng)免疫使用非完全弗氏佐劑，免疫劑量為100 μg/只。免疫周期為2周，每次免疫前1天，采集小鼠眼球血，以備后續(xù)檢測(cè)使用。將血清于37℃靜置30 min后，12 000 r/min離心10 min 取上清血清，并凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2免疫血清與抗原反應(yīng)性檢測(cè) 將免疫血清取1.5 μl稀釋于148.5 μl 20%NBS(含有20%胎牛血清的PBS)中，進(jìn)行3倍梯度稀釋，做ELISA檢測(cè)免疫血清與抗原的反應(yīng)性。

1.2.4.3免疫血清中和能力檢測(cè) 將免疫血清置于56℃水浴滅火30 min，首孔取12 μl血清溶于138 μl DMEM培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行3倍梯度稀釋，再與感染劑量為100個(gè)TCID50病毒孵育40～48 h。之后棄上清，用含有1%甲醛和0.2%戊二醛的PBS固定液固定細(xì)胞5 min，再用75 μl PBS清洗固定液兩次。然后加入顯色液顯色，37℃孵育1 h后用Elispot讀板數(shù)點(diǎn)計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1人重組CD4胞外區(qū)蛋白的制備和鑒定 利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)CD4胞外區(qū)蛋白。將本實(shí)驗(yàn)室留存的CD4胞外區(qū)基因序列，通過PCR和分子克隆技術(shù)導(dǎo)入到昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pAcgp67B中，然后利用桿狀病毒進(jìn)行表達(dá)。將昆蟲細(xì)胞上清用鎳柱純化，純化結(jié)果如圖1所示，SDS-PAGE顯示目的蛋白分子量大小在50 kD左右，其純度約90%，產(chǎn)量約11.2 mg/L，能夠滿足小鼠免疫的需求。Western blot結(jié)果顯示CD4胞外區(qū)蛋白成功表達(dá)。

2.2人重組CD4胞外區(qū)蛋白的活性分析 本研究通過體積排阻色譜、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等技術(shù)對(duì)目的蛋白各方面性質(zhì)進(jìn)行鑒定。通過HPSEC檢測(cè)，結(jié)果如圖2A顯示目的蛋白在溶液中均一性良好。經(jīng)過ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究所獲得的目的蛋白與目前市場(chǎng)上有的商品化可溶性CD4蛋白(soluble CD4,sCD4)抗原性相當(dāng)，如圖2B所示。同時(shí)如圖2C所示生物素標(biāo)記的目的蛋白與本實(shí)驗(yàn)室制備的HIV gp120蛋白有很好的反應(yīng)性，也說明該目的蛋白有較好的活性。通過CD4先與HIV病毒孵育阻斷病毒感染Tzmb1細(xì)胞，將目的蛋白以不同濃度梯度與HIV病毒孵育，二者相互結(jié)合，然后感染Tzmb1細(xì)胞，結(jié)果如圖2D所示，說明目的蛋白能夠與HIVNL4-3病毒結(jié)合，達(dá)到阻斷HIV病毒感染Tzmb1細(xì)胞的效果。以上結(jié)果均表明，經(jīng)鎳柱純化得到的目的蛋白在溶液中性質(zhì)均一且有比較好的抗原性。

圖1 CD4蛋白的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE and Western blot result of purified CD4 protein

圖2 CD4蛋白的理化性質(zhì)結(jié)果Fig.2 Characterization of CD4 proteinNote: A.HPSEC analysis;B.Antigenicity analysis using monoclonal antibodies 15A7;C.Antigenicity analysis using HIV gp120;D.Activity analysis using HIV virus;sCD4.Commercialized soluble CD4;CD4.CD4 from this study.

圖3 CD4蛋白的免疫原性結(jié)果Fig.3 Immunogenicity of CD4 proteinNote: A.Immunogenicity analysis using anti-CD4 mouse serum;B.Neutralization of anti-CD4 mouse serum to HIV.

利用SPR法檢測(cè)CD4與單抗15A7的結(jié)合活性，結(jié)果顯示，KD=1.96×10-9，Chi2=9.05，表明CD4與單抗15A7有良好的結(jié)合活性。

2.3人重組CD4胞外區(qū)蛋白的免疫原性分析 為了檢測(cè)獲得的目的蛋白的免疫原性，使用純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)小鼠血清結(jié)合與中和滴度。結(jié)果如圖3A、B所示，在第5針免疫之后，所有實(shí)驗(yàn)組小鼠(p1-p4)血清均與免疫原有較好的結(jié)合活性，且均對(duì)HIV NL4-3病毒具有不同程度的中和滴度。說明本研究的目的蛋白具有類似天然的構(gòu)象，具有較好的免疫原性，可以有效地刺激小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答產(chǎn)生中和抗體，可用于HIV抗體以及受體等的研究。

3 討論

人CD4分子在正常情況下，能夠參與機(jī)體的免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視功能。但當(dāng)其正常的免疫功能失調(diào)或者遭到破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致疾病[15]。因此CD4分子以及CD4單抗成為許多疾病的治療靶標(biāo)，如自身免疫病、移植排斥反應(yīng)、腫瘤以及AIDS等。能夠在體外大量表達(dá)CD4蛋白對(duì)于攻克這些疾病的研究具有非常重要的意義[4,13]。

早在20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)CD4分子以來，人們就開始嘗試?yán)酶鞣N表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)CD4蛋白。最初從淋巴細(xì)胞表面分離，再到利用原核表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)大腸桿菌表達(dá)，以及利用真核表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)[16]。但這些表達(dá)純化方法一般都比較復(fù)雜，且存在一些如原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾系統(tǒng)不完善等問題。相比以往的研究報(bào)道，本研究利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CD4胞外區(qū)蛋白[17-21]，不僅培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)少，而且運(yùn)用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，具有易于擴(kuò)大培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)利用昆蟲細(xì)胞內(nèi)源的gp67信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分泌表達(dá)，細(xì)胞上清利用鎳柱一步純化，即可得到純度較高的目的蛋白，純化方法簡(jiǎn)單快捷，每批次目的蛋白產(chǎn)量平均能夠達(dá)到11 mg/L。同時(shí)該昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的糖蛋白具有一定的糖基化修飾[22,23]，能夠滿足目的糖蛋白的表達(dá)需求，對(duì)于該系統(tǒng)表達(dá)純化得到人CD4胞外區(qū)蛋白，通過WB、ELISA、體積排阻色譜等結(jié)果，表明目的蛋白具有良好的抗原性以及在溶液中均一性良好。另外，小鼠免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明目的蛋白具有良好的免疫原性。因此，利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，能夠高效、簡(jiǎn)便、高量的表達(dá)純化得到人CD4胞外區(qū)蛋白，能夠?yàn)镃D4分子以及CD4抗體等的研究提供充足的原料。

隨著對(duì)CD4分子相關(guān)功能和機(jī)制的深入研究，CD4分子跨膜區(qū)以及胞質(zhì)區(qū)的功能逐漸被研究者挖掘，后續(xù)我們將嘗試?yán)脳U狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行CD4全長或其他功能區(qū)段蛋白的制備，為HIV受體和感染等方面的研究奠定基礎(chǔ)。