瞿秋紅 韋立蓓 尹 伶

(武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院婦產科,武漢 430064)

卵巢癌是常見的婦科腫瘤之一，近些年的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，且大多數(shù)患者確診時已處于晚期。目前主要以手術治療輔助放化療的治療方式，但患者的總體預后差，且五年的生存率低，因此，急需尋找有效的治療途徑[1,2]。近些年來，卵巢癌的免疫治療研究有了很大的突破，但臨床的治療效果卻不佳，其主要原因是腫瘤的免疫逃逸[3]。B7-H1為B7家族成員之一，通過結合于T細胞受體PD-1，抑制T細胞和B細胞的功能，引起腫瘤的免疫逃逸[4]。已有多項研究表明，在腫瘤相關巨噬細胞(TAM)上B7-H1出現(xiàn)高表達，可傳遞出共抑制信號而使T細胞的功能受到抑制[5,6]。卵巢癌組織中B7-H1出現(xiàn)高表達，與生存期短、預后差等相關，可作為免疫靶向治療卵巢癌的一個思路[7]。卵巢癌與巨噬細胞共培養(yǎng)后可引起B(yǎng)7-H1表達的升高[8]。目前TAM B7-H1的表達對卵巢癌生物學特性的影響還未清楚。因此，本研究在體外刺激人單核THP-1細胞成為巨噬細胞，并誘導為TAM，通過腺病毒載體系統(tǒng)過表達或抑制TAM中的B7-H1基因，檢測對卵巢癌細胞增殖侵襲的影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人卵巢癌CAOV3細胞及人單核THP-1細胞株均購自美國ATCC細胞庫；過表達及B7-H1 siRNA腺病毒載體及表達RFP對照的腺病毒載體購自上海澤葉生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；CCK8試劑購自上海同仁研究所；Transwell板購自美國Corning公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；B7-H1、Ki67、基質金屬蛋白2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、基質金屬蛋白9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(phosphorylated Janus kinase2，p-JAK2)和磷酸化的信號轉導與轉錄因子3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)抗體均購自美國CST公司；酶標儀購自美國Thermo Labsystem公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad。

1.2方法

1.2.1人M2型腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的誘導建立 參照文獻[9,10]方法對M2型巨噬細胞進行誘導：用PMA(10 ng/ml)處理THP-1細胞3 d，細胞被誘導貼壁并分化為成巨噬細胞，再用MCSF(10 ng/ml)處理細胞，使細胞最終分化成為M2型巨噬細胞。

1.2.2腺病毒轉染TAM及轉染后的細胞中B7-H1的表達 擴增B7-H1過表達腺病毒載體、B7-H1 siRNA腺病毒載體及表達RFP對照的腺病毒載體，其中表達RFP的載體系統(tǒng)攜帶RFP熒光蛋白，可用于測定巨噬細胞感染力，將細胞轉染M2巨噬細胞，并設置空白對照組。通過RT-PCR及Western blot檢測轉染后的細胞中B7-H1的表達。

1.2.3B7-H1的mRNA表達檢測 總RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，參照逆轉錄試劑盒反轉錄總RNA為cDNA，以cDNA為模板，20 μl體系，GAPDH為內參基因，通過熒光定量PCR對B7-H1的表達進行檢測。B7-H1和GAPDH的引物分別為：B7-H1：F：5′-GGTGGTGCCGACTACAAG-3′，R：5′-ATTGGTGGTGGTGGTCTTAC-3′;GAPDH ：F：5′-GTCACCAGGGCTGCTTTTAACTC-3′，R：5′-CAGCATCGCCCC-ACTTGATTTTG-3′。PCR反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，64℃退火20 s，72℃延伸30 s，共39個循環(huán)。采用2-ΔΔCt比較法根據(jù)RT-PCR得出的Ct均值計算B7-H1的mRNA相對含量。

1.2.4B7-H1的蛋白表達檢測 細胞中加入裂解液裂解30 min，離心后收集上清，BCA法對蛋白含量進行檢測，每泳道取等量蛋白樣品行SDS-PAGE，電泳結束后將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，含5%牛奶的封閉液封閉1 h，4℃孵育B7-H1和GAPDH抗體(分別按照1∶500和1∶1 000稀釋)，洗膜，加入二抗，孵育1 h后洗膜，ECL顯色液顯色，置于暗室中顯影曝光條帶。

1.2.5M2型巨噬細胞與卵巢癌細胞共培養(yǎng) 將處理后的M2型巨噬細胞分別與人卵巢癌CAOV3細胞共培養(yǎng)，使用只允許可溶性的細胞因子通過的0.4 μm Transwell小室于6孔培養(yǎng)板中，接種不同處理的TAM于每個小室內，6孔板接種卵巢癌細胞，共培養(yǎng)兩種細胞7 d進行后續(xù)的實驗研究。

1.2.6細胞活力檢測 通過CCK8法，消化離心單獨培養(yǎng)及與不同處理的TAM同培養(yǎng)7 d的卵巢癌細胞，制成單細胞懸液，接種96孔板，每組一個孔板，并設置3個復孔，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，觀察到細胞剛貼壁時開始計時，于培養(yǎng)的24、36、48 h，在每孔細胞中加CCK8試劑10 μl，37℃孵育1 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度值(A)。實驗重復3次。

1.2.7細胞侵襲檢測 將Matrigel膠用無血清培養(yǎng)基稀釋至終濃度為1 mg/ml，整個過程在冰上操作，Transwell小室上室加入稀釋后的Matrigel膠100 μl，37℃溫育4～5 h使之成為膠狀，上室中加入單獨培養(yǎng)及與不同處理的TAM同培養(yǎng)的卵巢癌細胞，下室中加入600 μl含血清的培養(yǎng)液，孵育箱中孵育2 h，取出小室，甲醇固定30 min，Giemsa染色30 min，顯微鏡下隨機選擇9個視野進行計數(shù)，統(tǒng)計結果。

1.2.8Ki67、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達檢測 各組細胞中Ki67、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達檢測參照1.2.4。

2 結果

2.1轉染后的巨噬細胞中B7-H1的表達 通過RT-PCR及Western blot檢測過表達及抑制B7-H1表達后的巨噬細胞中B7-H1的表達，結果如圖1和表1所示，Ad-RFP組B7-H1表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而Ad-siB7-H1組B7-H1的表達顯著低于對照組(P<0.05)，Ad-B7-H1組B7-H1的表達顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞活力的影響 通過CCK8法檢測單獨培養(yǎng)及與過表達或抑制B7-H1的TAM共培養(yǎng)的卵巢癌細胞的活力，結果如表2所示，與單獨培養(yǎng)組比較，TAM組在24、36和48 h的細胞活力均顯著升高，與RFP-TAM組比較，siB7-H1-TAM組在24、36和48 h的細胞活力均顯著降低，B7-H1-TAM組在24、36和48 h的細胞活力均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 轉染后的巨噬細胞中B7-H1的蛋白表達Fig.1 Protein expression of B7-H1 in macrophages after transfection

表1轉染后的巨噬細胞中B7-H1的mRNA及蛋白表達

Tab.1mRNAandproteinexpressionofB7-H1inmacrophagesaftertransfection

GroupsmRNA expressionof B7-H1Protein expressionof B7-H1Control group10.168±0.021Ad-RFP group1.018±0.1420.176±0.023Ad-siB7-H1 group0.217±0.0321)0.034±0.0081)Ad-B7-H1 group6.887±0.6471)0.715±0.0791)F 261.134 150.058P 0.000 0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

2.3轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞侵襲的影響 Alone組、TAM組、RFP-TAM組、siB7-H1-TAM組和B7-H1-TAM組細胞的侵襲率分別為(100.00±8.6)、(354.2±18.8)、(351.8±17.8)、(207.4±21.4)、(547.5±36.7)，5組細胞的侵襲率經單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義(F=168.752,P=0.000)，與Alone組比較，TAM組細胞侵襲能力顯著升高，與RFP-TAM組比較，siB7-H1-TAM組細胞侵襲能力顯著降低，B7-H1-TAM組細胞侵襲能力顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

表2轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞活力的影響

Tab.2EffectofoverexpressionorinhibitionofB7-H1TAMonviabilityofovariancancercells

GroupsOD24 h36 h48 hAlone group0.224±0.0270.302±0.0350.444±0.056TAM group0.337±0.0321)0.441±0.0481)0.682±0.0781)RFP-TAM group0.326±0.0300.429±0.0440.665±0.074siB7-H1-TAM group0.202±0.0242)0.304±0.0362)0.478±0.0512)B7-H1-TAM group0.465±0.0512)0.612±0.0662)0.879±0.0972)F28.34521.83717.360P0.0000.0000.000

Note：Compared with the alone group,1)P<0.05;compared with the RFP-TAM group,2)P<0.05.

圖2 轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞侵襲的影響Fig.2 Effect of overexpression or inhibition of B7-H1 TAM on invasion of ovarian cancer cellsNote:Compared with the alone group,*.P<0.05;compared with the RFP-TAM group,#.P<0.05.

圖3 轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞Ki67、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響Fig.3 Effect of overexpression or inhibition of B7-H1 TAM on expression of Ki67,MMP-2 and MMP-9 protein in ovarian cancer cells

表3轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞Ki67、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

Tab.3EffectofoverexpressionorinhibitionofB7-H1TAMonexpressionofKi67,MMP-2andMMP-9proteininovariancancercells

GroupsProtein relative expressionKi67MMP-2MMP-9Alone group0.036±0.0070.049±0.0080.102±0.010TAM group0.168±0.0211)0.389±0.0481)0.278±0.0311)RFP-TAM group0.154±0.0200.342±0.0430.261±0.030siB7-H1-TAM group0.078±0.0092)0.183±0.0232)0.124±0.0162)B7-H1-TAM group0.354±0.0422)0.788±0.0892)0.559±0.0652)F82.01592.34277.463P0.0000.0000.000

Note：Compared with the alone group,1)P<0.05;compared with the RFP-TAM group,2)P<0.05.

2.4轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞增殖侵襲蛋白表達的影響 通過Western blot檢測轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞增殖相關蛋白Ki67、侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響，結果如圖3和表3所示，與Alone組比較，TAM組Ki67、MMP-2和MMP-9的蛋白表達均顯著升高，與RFP-TAM組比較，siB7-H1-TAM組Ki67、MMP-2和MMP-9的蛋白表達均顯著降低，B7-H1-TAM組Ki67、MMP-2和MMP-9的蛋白表達均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5轉染過表達或抑制B7- H1的TAM對卵巢癌

圖4 轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞JAK2/STAT3信號通路的影響Fig.4 Effect of overexpressing or inhibiting B7-H1 TAM on JAK2/STAT3 signaling pathway in ovarian cancer cells

表4轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞JAK2/STAT3信號通路的影響

Tab.4EffectofoverexpressingorinhibitingB7-H1TAMonJAK2/STAT3signalingpathwayinovariancancercells

GroupsProtein relative expressionp-JAK2p-STAT3TAM group0.145±0.0191)0.263±0.0341)RFP-TAM group0.137±0.0170.245±0.032siB7-H1-TAM group0.068±0.0092)0.133±0.0182)B7-H1-TAM group0.348±0.0402)0.388±0.0462)F90.78153.509P0.0000.000

Note：Compared with the Alone group,1)P<0.05;compared with the RFP-TAM group,2)P<0.05.

細胞JAK2/STAT3信號通路的影響 Western blot檢測轉染過表達或抑制B7-H1的TAM對卵巢癌細胞JAK2/STAT3信號通路磷酸化的JAK2和STAT3的蛋白表達的影響，結果如圖4和表4所示，與Alone組比較，TAM組p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，與RFP-TAM組比較，siB7-H1-TAM組p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，B7-H1-TAM組p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。

3 討論

研究腫瘤的免疫治療為治療腫瘤帶來了希望，但在臨床上的實際治療效果并不理想，其中腫瘤介導的免疫逃逸是對多種腫瘤治療的一個主要障礙。因此，研究卵巢癌及其免疫系統(tǒng)間的關系，并尋找有效的治療策略具有重要意義。腫瘤組織中的巨噬細胞稱為TAM，TAM在促進腫瘤進展及抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用，TAM可通過上調基質金屬蛋白酶、蛋白水解酶等表達，溶解細胞外的基質及破壞基底膜，從而增加腫瘤的浸潤與轉移[11,12]。有研究顯示，M2型TAM與前列腺癌、肝癌等多種腫瘤的預后有關，可能成為治療腫瘤的靶點[13,14]。B7-H1是一個重要的負性調控分子，在免疫抑制微環(huán)境的維持及免疫逃逸中有重要作用,在很多慢性病患者、腫瘤組織等有高表達，在腫瘤中的異常表達與預后及惡性程度有關，其高表達患者惡性程度高，且預后差[15,16]。有研究顯示，下調腦膠質瘤中B7-H1的表達可抑制細胞的增殖和促進細胞凋亡[17]；B7-H1的表達影響胃腺癌患者的TAM數(shù)量[18]，B7-H1在卵巢癌中高表達，卵巢癌與TAM共培養(yǎng)可上調B7-H1的表達[8]，改變TAM中B7-H1的表達對卵巢癌生物學特性的影響還未清楚。

本研究通過腺病毒載體系統(tǒng)過表達或抑制TAM中的B7-H1基因，通過CCK8法及Transwell小室分別檢測卵巢癌細胞增殖及侵襲能力，結果顯示，卵巢癌與巨噬細胞共培養(yǎng)相對于單獨培養(yǎng)B7-H1的表達升高，而下調B7-H1的表達后癌細胞的增殖及侵襲能力均明顯降低，上調B7-H1的表達反之。Ki67是一個細胞增殖核抗原，是檢測細胞增殖活性的一個可靠指標，與腫瘤細胞及組織的生長、轉移、侵襲和復發(fā)相關[19,20]。有研究顯示，乳腺癌組織中Ki67與B7-H1呈正相關[21]。MMP-2和MMP-9為MMPs家族的兩個重要成員，在卵巢的侵襲及轉移過程中有重要作用，影響卵巢癌的預后及進展[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，TAM在受到趨化性細胞因子刺激后，可釋放出MMPs，腫瘤細胞易發(fā)生脫落，從而間接引起腫瘤的侵襲和轉移[23]。肺癌細胞與TAM共培養(yǎng)后可增加細胞內MMP-9的表達[24]；胃癌與TAM共培養(yǎng)后MMP-2和MMP-9的表達均明顯上調[25]。本研究的結果顯示，卵巢癌與TAM共培養(yǎng)后Ki67、MMP-2和MMP-9的表達相對于單獨培養(yǎng)升高，這與前人在其他腫瘤中的研究是一致的，下調B7-H1的表達后細胞中Ki67、MMP-2和MMP-9的表達均顯著降低，而上調B7-H1表達反之。這提示B7-H1可通過調節(jié)Ki67、MMP-2和MMP-9的表達影響卵巢癌的增殖和侵襲能力。JAK2/STAT3信號通路的持續(xù)激活可引起異常的細胞增殖及惡性轉化，導致多種人類腫瘤的發(fā)生[26]。卵巢癌細胞中可通過調節(jié)JAK2/STAT3信號通路降低癌細胞的增殖及誘導凋亡[27]。阻斷JAK2/STAT3信號通路可降低B7-H1的表達[28]。本研究檢測JAK2/STAT3信號通路p-JAK2和p-STAT3的表達，結果顯示，卵巢癌與TAM共培養(yǎng)后p-JAK2和p-STAT3的表達均顯著升高，而抑制B7-H1的表達后可降低p-JAK2和p-STAT3的表達，過表達B7-H1反之。這提示B7-H1可通過抑制JAK2/STAT3信號通路影響卵巢癌生物學特性。

綜上所述，抑制TAM B7-H1基因可抑制卵巢癌細胞活力及侵襲能力，下調JAK2/STAT3信號通路，過表達B7-H1可增強卵巢癌細胞活力和侵襲能力，上調JAK2/STAT3信號通路。其中對細胞增殖侵襲作用方式是下調Ki67、MMP-2和MMP-9表達。本研究提示B7-H1可能是卵巢癌免疫治療的一個新的靶點，但本研究內容有限，且未在體內實驗驗證。但TAM中B7-H1的作用值得進一步深入探討。