李魯宏 李志超 洪文婷

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,泉州 362000)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性40歲前卵巢發(fā)生病變，導(dǎo)致卵巢功能衰退，表現(xiàn)為月經(jīng)稀少或閉經(jīng)，并伴隨各種并發(fā)癥，在生育期的女性中發(fā)病率為0.5%～3.0%，是嚴(yán)重影響婦女身心健康的疾病[1]。中醫(yī)認(rèn)為，卵巢早衰發(fā)生的原因是天葵早竭，臨床上治療主要以滋陰、補(bǔ)腎、填精為基本原則[2]。歸腎丸最早出自《景岳全書(shū)》，由熟地黃、山藥、山茱萸等組成，主要用于治療腎水不足、精衰血少、腰酸腳軟、形容憔悴、遺泄陽(yáng)衰等癥。研究表明，歸腎丸能夠治療卵巢功能早衰、腎虛黃體功能不健癥、更年期綜合征、多囊卵巢綜合征等，對(duì)增強(qiáng)卵巢儲(chǔ)備力、調(diào)節(jié)月經(jīng)周期等具有顯著療效[3,4]。免疫細(xì)胞在卵巢早衰中起著重要的保護(hù)作用，主要分為B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的70%左右，其增殖能力能準(zhǔn)確反映機(jī)體免疫能力[5]。CD4+與CD8+T細(xì)胞是細(xì)胞免疫中發(fā)揮主要作用的T淋巴細(xì)胞亞群，CD4+T細(xì)胞為輔助性淋巴細(xì)胞，而CD8+為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，主要功能是特異性殺傷靶細(xì)胞[6]。研究表明，T淋巴細(xì)胞分泌的炎性因子IFN-γ、IL-2等可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞及黃體細(xì)胞MHCⅡ類(lèi)抗原表達(dá)誘發(fā)自身免疫應(yīng)答，使顆粒細(xì)胞和卵泡受到破壞，導(dǎo)致卵巢早衰發(fā)生[7]。T淋巴細(xì)胞增殖能力、T淋巴細(xì)胞亞群水平、細(xì)胞因子表達(dá)這幾個(gè)方面可以充分反映機(jī)體細(xì)胞免疫表達(dá)情況，為此，本研究通過(guò)觀察歸腎丸對(duì)卵巢早衰模型小鼠的細(xì)胞免疫方面的影響，探討其改善卵巢功能、治療卵巢早衰的機(jī)理，為研究歸腎丸治療卵巢早衰提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠60只，1月齡，體重18～22 g，由福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 實(shí)驗(yàn)室溫度為22～25℃，濕度為50%～65%，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境符合SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求。

1.1.2儀器和試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；超純水機(jī)(美國(guó)Milli-pore公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Awareness公司)。歸腎丸：熟地黃20 g、菟絲子20 g、枸杞子15 g、杜仲10 g、山茱萸10 g、當(dāng)歸10 g、山藥20 g、茯苓10 g，由廣東省中醫(yī)院中藥房提供。藥材浸泡1 h，武火煮沸，文火煎煮1 h，過(guò)濾，重復(fù)煎煮2次，合并2次煎煮藥液，濃縮，置于4℃下保存。小鼠透明帶3多肽溶液(杭州中肽生化有限公司)；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma公司)；醋酸潑尼松片(云南白藥集團(tuán)股份有限公司)；IFN-γ、IL-2放射免疫分析試劑盒(北京邦定泰克生物技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備 按照文獻(xiàn)[8]方法，以小鼠透明帶3多肽溶液為免疫抗原，加入等量弗氏完全佐劑，取0.04 ml在BALB/c小鼠的足底及腹部皮膚皮下連續(xù)3次多點(diǎn)注射，皮下每點(diǎn)0.12 ml，皮下5點(diǎn)共注射0.2 ml/只，分別于14、28 d后把小鼠透明帶3多肽溶液加入等量弗氏不完全佐劑，以同樣方法對(duì)小鼠足底及腹部皮膚皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫。于造模前后測(cè)定小鼠的動(dòng)情周期，取無(wú)菌棉簽，以生理鹽水浸潤(rùn)后輕輕插入小鼠陰道內(nèi)，稍轉(zhuǎn)一下后抽出，取得陰道分泌物涂在乙醇浸泡過(guò)的載玻片上，巴氏染色，用光學(xué)顯微鏡觀察脫落細(xì)胞，根據(jù)脫落細(xì)胞數(shù)判定動(dòng)情周期，連續(xù)10 d觀測(cè)到持續(xù)動(dòng)情間期，視為卵巢早衰小鼠模型建立成功。

1.2.2分組與給藥 取60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、潑尼松組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。模型組、潑尼松組、高劑量組、中劑量組、低劑量組按“1.2.1”項(xiàng)方法造模。造模15 d后，空白對(duì)照組與模型組給予相同劑量的生理鹽水灌胃，歸腎丸高劑量組、中劑量組、低劑量組分別給予48、24、12 g/kg灌胃，1次/d。

1.2.3樣本的采集 給藥28 d 后取小鼠摘眼球取血，室溫放置1 h后，置于3 500 r/min下離心5 min，取上層血清于-80℃冰箱保存。取血后，頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌條件下取脾臟、胸腺和雙側(cè)卵巢，洗滌后用濾紙吸干，稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)，計(jì)算公式如下。臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體重(g)。

1.2.4T淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定 取小鼠脾臟，研磨后于40 μmol/L細(xì)胞篩過(guò)濾，收集脾臟單細(xì)胞懸液，將制備好的脾細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，其中3孔加入100 μl ConA(5 μg/ml)，另外3孔不加ConA。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，取出，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100 μl 10%的SDS，搖勻，4 h后在酶檢儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白OD值)。

1.2.5T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的測(cè)定 分別取1.2.4中制得的細(xì)胞懸液100 μl(含1×106個(gè)細(xì)胞)，分別加入單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD56，置于4℃冰箱避光染色30 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，置于2 500 r/min離心5 min，棄去上清液，于沉淀細(xì)胞內(nèi)加500 μl PBS，混勻，上流式細(xì)胞儀以CD3為設(shè)門(mén)，將CD3+T細(xì)胞圈出，檢測(cè)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比。

1.2.6IFN-γ、IL-2的測(cè)定 取小鼠血清按 IL-1β 和IFN-γ 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1歸腎丸對(duì)動(dòng)情周期的影響 模型組小鼠動(dòng)情周期顯著長(zhǎng)于空白對(duì)照組(P<0.05)，與模型組相比，高、中、低劑量組小鼠的動(dòng)情周期顯著縮短(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

GroupsEstrum cycle(d)Anoestrus(d)Blank control group4.92±0.533.54±0.65Model group7.84±0.631)7.02±0.891)Prednisone group5.03±0.722)3.72±0.542)High dose group5.13±0.642)3.62±0.652)Middle dose group5.93±0.562)4.34±0.582)Low dose group6.95±0.772)5.86±0.822)

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsSpleenindex(mg/g)Thymusindex(mg/g)Ovaryindex(mg/g)Blank control group4.35±0.470.22±0.030.058±0.005Model group2.52±0.501)0.10±0.021)0.040±0.0031)Prednisone group4.10±0.522)0.20±0.012)0.054±0.0042)High dose group4.28±0.372)0.20±0.022)0.055±0.0032)Middle dose group3.84±0.712)0.17±0.022)0.050±0.0032)Low dose group3.28±0.752)0.15±0.022)0.048±0.0042)

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsOD valueBlank control group1.25±0.03Model group0.53±0.041)Prednisone group1.16±0.052)High dose group1.20±0.032)Middle dose group1.08±0.062)Low dose group0.92±0.022)

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsCD3+T(%)CD4+T(%)CD8+T(%)CD4+T/CD8+T(%)NK cells(%)Blank control group40.05±5.6429.97±2.139.43±1.153.21±0.352.05±0.36Model group30.44±4.3718.06±1.381)12.25±0.941)1.49±0.191)4.63±0.451)Prednisone group35.72±5.212)27.41±1.582)9.35±1.312)2.99±0.472)2.43±0.332)High dose group36.97±4.602)28.88±1.502)9.16±1.022)3.18±0.262)2.26±0.302)Middle dose group35.42±3.442)25.63±1.092)9.56±0.962)2.71±0.312)2.83±0.462)Low dose group31.43±4.5321.33±1.792)10.49±0.802)2.04±0.252)3.63±0.222)

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

2.2歸腎丸對(duì)臟器指數(shù)的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、卵巢指數(shù)均下降(P<0.05)。與模型組相比，潑尼松組、歸腎丸高、中、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、卵巢指數(shù)均顯著升高(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3歸腎丸對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著低于空白對(duì)照品(P<0.05)，與模型組相比，高、中、低劑量組小鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著升高(P<0.05)，空白對(duì)照組小鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖能力與高中、低劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4歸腎丸對(duì)T細(xì)胞亞群的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T比值顯著降低(P<0.05)，CD8+T和NK細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，潑尼松組、歸腎丸高、中、低劑量組小鼠CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T比值升高(P<0.05)，CD8+T、NK細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表4，圖1、2。

2.5歸腎丸對(duì)IFN-γ、IL-2水平的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的IFN-γ、IL-2水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，潑尼松組、歸腎丸高、中、低劑量組小鼠的IFN-γ、IL-2水平顯著升高(P<

圖1 各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群分析圖Fig.1 Cytometric analysis of T lymphocyte subsets of mice in each groupNote:A.Blank control group;B.Model group;C.Prednisone group;D.High dose group;E.Middle dose group;F.Low dose group.

圖2 各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞百分比柱狀圖Fig.2 Histogram of T lymphocyte subsets and NK cells of mice in each

GroupsIFN-γ(pg/ml)IL-2(pg/ml)Blank control group76.97±4.5636.25±3.26Model group42.86±4.891)21.45±2.881)Prednisone group74.52±4.482)32.49±4.622)High dose group75.61±4.652)33.87±3.712)Middle dose group70.10±4.282)31.99±3.552)Low dose group59.85±4.302)25.86±3.032)

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖3 各組小鼠血清IFN-γ、IL-2 的水平柱狀圖Fig.3 Histogram of IFN-γ,IL-2 of mice in each group

0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5、圖3。

3 討論

歸腎丸由熟地黃、山藥、山茱萸等中藥組成，具有補(bǔ)腎填精的功效，被廣泛運(yùn)用于婦科疾病，主治腎水真陰不足、精衰血少、腰酸腳軟、形容憔悴、遺泄陽(yáng)衰等癥。研究表明，歸腎丸具有抗卵巢早衰、提高卵巢儲(chǔ)備能力、恢復(fù)正常月經(jīng)周期、延緩衰老的作用[3]。本研究通過(guò)觀察歸腎丸對(duì)卵巢早衰小鼠模型的臟器指標(biāo)、T細(xì)胞亞群與細(xì)胞因子表達(dá)的變化規(guī)律，探討其對(duì)細(xì)胞免疫的影響。

動(dòng)情周期能夠反映出卵巢內(nèi)分泌功能，本研究中模型組小鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂、延長(zhǎng)，部分小鼠動(dòng)情周期在動(dòng)情后期或間期，表明以小鼠透明帶3多肽溶液為免疫抗原可有效建立小鼠卵巢早衰模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，歸腎丸高、低、中劑量組小鼠的動(dòng)情周期顯著縮短。免疫細(xì)胞增殖與分化對(duì)脾臟和胸腺有重要影響，胸腺和脾臟指數(shù)的高低可以反映出機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，歸腎丸高、中、低劑量組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)都顯著增高，歸腎丸高劑量組小鼠的治療效果與潑尼松組治療效果相近。此外，歸腎丸能夠提高歸腎丸高、中、低劑量組小鼠卵巢指數(shù)，以上結(jié)果表明歸腎丸能夠起到保護(hù)免疫器官，增強(qiáng)免疫的作用。

CD4+T和CD8+T是T淋巴細(xì)胞的兩個(gè)亞群，其中CD4+T淋巴細(xì)胞主要通過(guò)激活自身分泌的細(xì)胞因子和趨化因子實(shí)現(xiàn)其免疫作用，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用[10]。CD8+T淋巴細(xì)胞直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞，是早期免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組小鼠CD8+T細(xì)胞升高及CD4+/CD8+比值下降，表明與卵巢早衰導(dǎo)致的自身免疫功能紊亂密切相關(guān)，卵巢功能減退導(dǎo)致閉經(jīng)時(shí)，CD8+T細(xì)胞的升高是自身免疫性卵巢炎在外周血中的體現(xiàn)。NK細(xì)胞是體內(nèi)的自然殺傷細(xì)胞，IFN-γ和IL-2是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子，IFN-γ和IL-2的表達(dá)可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御功能[12]。研究表明，免疫力低下小鼠模型的CD4+T細(xì)胞水平和IFN-γ、IL-2水平都低表達(dá)[13]。IFN-γ與NK細(xì)胞表面受體結(jié)合后，可增強(qiáng)NK細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞受體結(jié)合能力、提高其溶解及殺傷靶細(xì)胞的活性，IL-2可刺激NK細(xì)胞不斷增殖分化，表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷力[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，歸腎丸可增加POF模型小鼠CD3+T、CD4+T、NK細(xì)胞數(shù)量，提高CD4+T/CD8+T比值，升高IFN-γ、IL-2含量水平，降低CD8+T淋巴細(xì)胞水平，表明歸腎丸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的T細(xì)胞亞群平衡，調(diào)節(jié)卵巢早衰導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，為臨床上運(yùn)用歸腎丸治療卵巢早衰提供了理論基礎(chǔ)。