李 玲 吳佳敏 歐陽建軍 胡 玨 廖 燦 袁 娉 魏 科 盧芳國

(湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，長沙 410208)

流感病毒性肺炎是由于機體感染流感病毒而引起的，其傳染率高，流行面廣，死亡率高，且流感病毒感染后臨床表現(xiàn)輕重不一，又以A型流感病毒抗原變異性最強[1-3]。中國幾千年以來與疾病斗爭的過程中留下了許多經(jīng)典的中藥復方，使得疾病得到了很好的治療和控制。流感病毒性肺炎屬于中醫(yī)“外感”疾病的范疇，中藥復方對于流感病毒性肺炎的治療具有其獨特的優(yōu)勢性和發(fā)展前景，尤其體現(xiàn)在免疫功能的調(diào)節(jié)上。目前治療相關(guān)疾病的中藥復方數(shù)量繁多[4]，但對流感病毒性肺炎的療效不一[5-7]，且不同的中藥復方作用機制不盡相同，大多數(shù)作用機制尚未明確，故對于防治流感病毒性肺炎的有效中藥復方進行篩選，并對其進行機制探究，非常有必要，并有利于中藥復方更好的開發(fā)和應用于臨床。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)將免疫抑制劑環(huán)磷酰胺運用于流感病毒性肺炎小鼠模型的制備[8,9]，可使小鼠的免疫功能受到短暫的抑制，提高小鼠的患病率，從而得到一個穩(wěn)定的流感病毒性肺炎模型，故本項目將免疫學原理運用于流感病毒性肺炎動物模型的制備，從而篩選出有效防治流感病毒性肺炎的中藥復方，并進一步探討該復方的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 湖南斯萊克景達實驗動物有限公司所購得昆明小鼠，雌雄各半，共164只。動物質(zhì)量合格證號：43004700016764，實驗單位使用許可證編號：SYXK(湘)2013-0005。

1.1.2主要試劑及設備 ELISA試劑盒(上海晶天，批號20161108)；HE染色試劑盒(索萊寶，批號20160831)；BCA試劑盒(上海康為，批號00171509)；IL-2兔多克隆抗體(Proteintech，26156-1-AP)；IL-4兔多克隆抗體(Proteintech，16545-1-AP)；TNF-α兔多克隆抗體(Proteintech，26156-1-AP)；ELX800-酶標儀(美國Bio-tek，ELX800)；化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-tek，ChemiDoc XRS)。

1.2方法

1.2.1病毒株及病毒攻毒量配制 流感病毒小鼠肺適應株(A型，IAV，A/PR/8/34)，由湖南師范大學病毒研究室惠贈。經(jīng)10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價1∶640以上者供試驗用。將病毒尿囊液以滅菌生理鹽水稀釋成50LD50(0.1 ml)-1(MOI=2.0)置于冰袋中備用。

1.2.2藥物制備 中藥復方購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學中藥分析教研室周日寶教授鑒定均為正品，上述藥物、劑量及煎煮方式均遵守高等中醫(yī)藥學教材《方劑學》(十二五規(guī)劃教材)和《中藥藥理學》所載制備中藥復方水煎液1 g/ml，于4℃冰箱中備用。根據(jù)《中藥藥理實驗方法學》人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表，換算得出各中藥復方的臨床等效劑量。磷酸奧司他韋膠囊(瑞士羅氏公司，批號H20090377)，環(huán)磷酰胺(索萊寶公司，批號302A034)，按動物體表面積劑量換算法，中藥復方臨床給藥劑量見表1，磷酸奧司他韋膠囊 21.63 mg/(kg·d)，麻杏石甘湯低劑量為1/2倍臨床等效劑量、麻杏石甘湯中劑量為臨床等效劑量、麻杏石甘湯高劑量為2倍臨床等效劑量。

1.2.3實驗分組及干預方式 ①中藥復方篩選：用75 mg/(kg·d)的環(huán)磷酰胺經(jīng)腹腔注射0.4 ml/只，兩天1次，一共2次，于4 d后進行A型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒性肺炎小鼠模型。隨機取5只模型小鼠做肺部病理檢測，判斷模型成功且穩(wěn)定后，將模型小鼠隨機分組為：桂枝湯(GZT)、小柴胡湯(XCHT)、小青龍湯(XQLT)、桑菊飲(SJY)、清肺湯(QFT)、麻杏石甘湯(MXSGT)、葛根湯(GGT)、銀翹散 (SJY)、桂枝麻黃各半湯(GZMHGBT)和大青龍湯組(XQLT)，同步設奧司他韋組(Oseltamivir)、模型組(Model)和正常組(Sham)，8只/組，灌胃給予相應的臨床等效劑量藥物，1次/d，共7 d，7 d后處理動物取材。②有效中藥復方的機制研究：用同中藥復方篩選實驗的造模方式進行模型制備和判定，實驗設正常組、模型組、奧司他韋組、麻杏石甘湯高、中、低劑量組，10只/組。灌胃給予相應藥物或生理鹽水，1次/d，共7 d，7 d后處理動物取材。

1.2.4檢測指標

`1.2.4.1脾指數(shù)的計算公式：①脾指數(shù)(%)=脾重量(mg)/小鼠體重(g);②肺指數(shù)(%)=肺重量(mg)/小鼠體重(g);③胸腺指數(shù)(%)=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)。

表1中藥復方的組成及臨床用量

Tab.1CompositionandclinicaldosageofChineseherbalcompound

MedicineConstituentClinical dosage[mg/(kg·d)]Gui Zhi Decoction,GZTCinnamomi Ramulus 9 g,Radix Paeoniae Alba 9 g,Zingiberis Rhizoma Recens 9 g,Jujubae Fructus 9 g,Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Pra-epata Cum Melle 6 g5.0Xiao Chai Hu Decoction,XCHTBupleuri Radix 12 g,Scutellaria baicalensis Georgi 9 g,Ginseng Radix Et Rhizoma 6 g,Rhizoma Pinelliae 9 g,Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praepata Cum Melle 5 g,Zingiberis Rhizoma Recense 9 g,Jujubae Fruc-tus 4 Pieces6.7Xiao Qing Long Decoction,XQLTEphedrae Herba 9 g, Cinnamomi Ramulus 9 g, Rhizoma Zingiberis 9 g,Asari Radix Et Rhizoma 3 g,Schisandrae chinensis Frutcus 6 g,Ra-dix Paeoniae Alba 9 g,Rhizoma Pinelliae 12 g,Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praepata Cum Melle 6 g6.5Sang Ju Ying Decoction,SJYMori Folium 7.5 g,Chrysanthemi Flos 3 g,Armeniacae Semen Ama-rum 6 g, Foesythiae Fructus 5 g, Menthae Haplocalycis Herba 2.5 g,Platycodonis Radix 6 g,Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praepata Cum Melle 2.5 g,Phragmitis Rhizoma 6 g5.0Qing Fei Decoction,QFTCoicis Sem 23 g,Stephaniae Tetrandrae Radix 23 g,Armeniacae Semen Amarum 23 g,Benincasae Semen 23 g,Phoenix Clothing 7.5 g13Ma Xing Shi GanDecoction,MXSGTEphedrae Herba 6 g,Armeniacae Semen Amarum 9 g,Gypsum Fibro-sum 24 g,Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praepata Cum Melle 6 g6Ge Geng Decoction,GGTPuerariae Lobatae Rad 6 g,Cimicifugae Rhizoma 3 g,Gentianae Macro-phyllae Radix 3 g,Schizonepetae Herba 3 g, Paeoniae Radix Rubra 3 g,Perillae Folium 2.4 g,Angelicae Dahuricae Radix 2.4 g,Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praepata Cum Melle 1.5 g,Zingiberis Rhizoma Re-cens 2tablets3.5Ying Qiao San Decoction,YQSFoesythiae Fructus 9 g,Lonnicerae Japonicae Flos 9 g,Platycodonis Ra-dix 6 g,Menthae Haplocalycis Herba 6 g,Lophatheri Herba 4 g,Gly-cyrrhizae Radix Et Rhizoma Praepata Cum Melle 5 g,Schizonepetae Herba Carbonisata 5 g,Sojae Semen Praepapatum 5 g,Arctii Fructus 9 g7.5Gui Zhi Ma Huang GeBan Decoction,GZMHGBTCinnamomi Ramulus 3 g,Radix Paeoniae Alba 3 g,Zingiberis Rhizoma Recens 3 g,Glycyrrhiza uralensis Fisch. 3 g,Ephedrae Herba 3 g,Ju-jubae Fructus 4,Armeniacae Semen Amarum 4 g2.5Da Qing Long Decoction,DQLTEphedrae Herba 12 g,Cinnamomi Ramulus 4 g,Glycyrrhizae Radix Et Rhi-zoma Praepata Cum Melle 5 g,Armeniacae Semen Amarum 6 g,Zingiberis Rhizoma Recens 9 g,Jujubae Fructus 10 g,Gypsum Fibrosum 20 g8.5

1.2.4.2ELISA法檢測肺泡灌洗液中IL-2、IL-4、TNF-α的含量 沿氣管完整取下肺，結(jié)扎右肺上葉，經(jīng)氣管用PBS 1.5 ml灌洗肺部，共灌洗2次，收集支氣管肺泡灌洗液約2 ml，1 000 r/min離心15 min，留取上清液置-20℃保存。用ELISA法檢測各組小鼠肺泡灌洗液中IL-2、IL-4、TNF-α的含量。

1.2.4.3HE法檢測肺病理變化 取肺組織于4%的多聚甲醛中固定、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，間斷連續(xù)5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.2.4.4Western blot法定性檢測肺組織中IL-2、IL-4、TNF-α蛋白的表達 取肺組織50 mg于液氮中研磨致粉末，提取組織總蛋白質(zhì)，應用BCA法測定蛋白含量，取50 μg總蛋白上樣。進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，封閉處理1 h，加入一抗IL-2、IL-4、 TNF-α兔抗鼠多克隆抗體(1∶1 000)，孵育過夜，二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光后于化學發(fā)光成像儀中檢測。成像圖片用軟件IPP6.0分析，取累積光密度(IOD)做統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1中藥復方的篩選結(jié)果

2.1.1各組小鼠脾指數(shù)的比較 如圖1所示，病毒感染的第1天(環(huán)磷酰胺干預后第4天)，模型組(Model1)小鼠的免疫功能明顯下降，體現(xiàn)在脾指數(shù)下降，與正常組(Sham1)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，加入病毒刺激后，引起機體自身免疫反應，體現(xiàn)在病毒感染第7天的模型組(Model2)小鼠脾指數(shù)較正常組(Sham2)呈現(xiàn)一定程度的增加，但肺病理結(jié)果顯示模型組肺部炎癥損傷較重，說明機體自身的免疫反應并不能有效抑制病毒的復制。而藥物干預各組結(jié)果顯示：麻杏石甘湯組能一定程度上調(diào)脾指數(shù)，說明該復方可能通過加強機體的免疫反應抑制病毒的復制，與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且效果稍優(yōu)于陽性藥物奧司他韋。其次中藥復方葛根湯、大青龍湯、銀翹散和小青龍湯的干預效果也較為明顯。(Sham1和Sham2、Model1和Model2是同一組，只是在不同的時間取材)。

2.1.2各組小鼠肺組織病理變化的比較 如圖2所示，模型組小鼠肺病理結(jié)果顯示：肺間質(zhì)增寬、炎癥細胞浸潤、肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴重等肺間質(zhì)性肺炎樣改變。而藥物干預各組結(jié)果顯示：以麻杏石甘湯組和奧司他韋組療效最佳。其次為小柴胡湯組、銀翹散組、葛根湯組的干預效果也較為明顯。

2.2有效中藥復方研究

2.2.1各組小鼠一般情況的比較 如圖3所示，模型組小鼠體重和胸腺指數(shù)明顯下降，肺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯升高，與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其余各藥物干預組，均能不同程度改善小鼠的一般情況，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，且麻杏石甘湯三個劑量組呈一定的量效關(guān)系，其中麻杏石甘湯高、中劑量組可提高體重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，降低肺指數(shù)與陽性藥物奧司他韋療效相當。

圖1 各組小鼠脾指數(shù)的比較Fig.1 Comparison of spleen index in miceNote: **.P<0.01 vs Sham1;##.P<0.01 vs Model1;△△.P<0.01 vs Sham2；▲▲.P<0.01；▲.P<0.05 vs Model2.

2.2.2各組小鼠肺組織病理變化的比較 如圖4所示，模型組小鼠肺組織大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡間質(zhì)增寬，肺泡結(jié)構(gòu)損傷嚴重，與正常組比較，差異顯著；麻杏石甘湯三個劑量組,均能不同程度改善肺部炎癥且與麻杏石甘湯呈一定的量效關(guān)系，其中麻杏石甘湯中、高劑量組改善肺部炎癥程度與陽性藥奧司他韋療效相當。

圖2 各組小鼠肺組織病理變化的比較(HE染色，×200)Fig.2 Pathological changes of lung tissue of mice(HE，×200)

圖3 各組小鼠體重、肺指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的比較Fig.3 Body weight,lung index,spleen index and thymus index of miceNote: *.P<0.05 vs Sham；**.P<0.01 vs Sham；#.P<0.05 vs Model；##.P<0.01 vs Model.

圖4 各組小鼠肺組織病理變化的比較(HE染色，×200)Fig.4 Pathological changes of lung tissue of mice(HE，×200)

圖5 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-2、IL-4、TNF-α含量的比較Fig.5 Contents of IL-2,IL-4 and TNF-α in BALF of miceNote: **.P<0.01 vs Sham；##.P<0.01 vs Model.

圖6 各組小鼠肺組織中IL-2、IL-4、TNF-α蛋白表達情況的比較Fig.6 Relative protein expression of IL-2,IL-4,TNF-α in lung tissue of miceNote: **.P<0.01，vs Sham；##.P<0.01，vs Model.

2.2.3各組小鼠肺泡灌洗液中IL-2、IL-4、TNF-α含量的比較 如圖5所示，模型組肺泡灌洗液中 TNF-α含量增加，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，各藥物干預組IL-2、IL-4含量不同程度的增加，而TNF-α含量不同程度的減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；其中麻杏石甘湯各劑量組與肺泡灌洗液中細胞因子的含量呈一定的相關(guān)性。

2.2.4各組小鼠肺組織中IL-2、IL-4、TNF-α蛋白表達情況的比較 如圖6所示，模型組肺組織中IL-2、IL-4蛋白表達減少，TNF-α蛋白表達增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各藥物干預組IL-2、IL-4蛋白表達不同程度的增加，而TNF-α蛋白表達不同程度的減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；麻杏石甘湯各劑量組與肺泡灌洗液中炎癥因子的含量呈一定的相關(guān)性，其中麻杏石甘湯中、高劑量調(diào)控細胞因子蛋白表達的能力與陽性藥物奧司他韋相當。

2.2.5有效中藥復方研究結(jié)果 由以上結(jié)果可以得出麻杏石甘湯可能通過提高機體免疫功能，上調(diào)IL-2、IL-4和下調(diào)TNF-α的蛋白表達，調(diào)控細胞因子的分泌，從而減輕小鼠肺部炎癥，改善其一般狀況，從而起到治療病毒性肺炎的作用。麻杏石甘湯的療效與其給藥劑量呈正相關(guān)，其中，麻杏石甘湯中、高劑量組總體療效最為明顯。

3 討論

流感病毒性肺炎是臨床上高發(fā)的一種疾病，然而該模型在實驗室制備過程中具有一定的難度。目前臨床中治療流感病毒的藥物十分匱乏，亟待新藥物的開發(fā)，而流感病毒性肺炎模型制備困難，無疑為此增加了難度。本課題組研究發(fā)現(xiàn)將免疫學原理運用于模型的制備可以提高該模型的成功率和模型的穩(wěn)定性。眾所周知，機體感染流感病毒可引起肺部間質(zhì)性肺炎，對肺部造成一定損傷，同時機體內(nèi)存在著大量不同的炎癥因子，在流感病毒性肺炎發(fā)病過程中發(fā)揮了不同的作用。IL-2主要由T細胞產(chǎn)生，其可以促進T細胞增殖、分化的同時又能進一步激活NK細胞產(chǎn)生干擾素，起到抗病毒作用，長期以來，IL-2在機體增強免疫應答中發(fā)揮了重要作用并得到了廣泛的肯定[10]。TNF-α作為炎癥介質(zhì)，可以增高炎癥細胞的趨化作用，并激活、誘導T、B細胞分化，但其在免疫反應過程中過量釋放，導致大量的炎癥細胞在局部組織浸潤增生。IL-4是活化的Th2產(chǎn)生的細胞因子，能夠增強B細胞介導的體液免疫應答[11]。

本研究通過對治療流感病毒性肺炎的中藥復方進行篩選，研究發(fā)現(xiàn)，感染病毒的第1天(即環(huán)磷酰胺干預后第4天)，模型小鼠的脾指數(shù)下降，而于病毒感染后第7天的模型小鼠脾指數(shù)呈現(xiàn)一定程度地增加，推測其原因為加入病毒刺激后，引起機體自身免疫反應，但肺病理結(jié)果顯示模型組肺部炎癥損傷較重，說明機體自身的免疫反應并不能有效抑制病毒的復制。而藥物干預各組結(jié)果顯示：麻杏石甘湯組能一定程度上調(diào)脾指數(shù)，并且改善肺部的炎癥，說明該復方可能通過加強機體的免疫反應抑制病毒的復制，其改善肺部炎癥的作用相比于其他中藥復方，效果明顯，且稍優(yōu)于陽性藥物奧司他韋。其次中藥復方葛根湯、小柴胡湯、大青龍湯、銀翹散和小青龍湯也具有較為明顯干預效果，由以上結(jié)果可得出以麻杏石甘湯療效最佳。在對麻杏石甘湯進行進一步探究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯各劑量組均可以不同程度的改善小鼠的一般情況、減少肺部的炎癥反應、上調(diào)IL-2和IL-4的蛋白表達和分泌水平、下調(diào)TNF-α的蛋白表達和分泌水平，與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，由此可見麻杏石甘湯可以通過調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，平衡細胞因子的表達，從而減輕小鼠肺部炎癥，起到治療作用，并且其劑量與療效呈一定的量效關(guān)系，其中高、中劑量組療效優(yōu)于低劑量組，而高、中劑量組療效無明顯差異，但其具體的作用機制和該方是否還有其他作用靶點，還有待進一步研究。