賈 蕾 史 娟

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，延安 716000)

星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中占的體積最大，參與多種疾病的病理過程[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可引起腦損傷，并可使AS活性及增殖明顯增強(qiáng)，抑制AS的活化可明顯提高圍產(chǎn)期腦損傷預(yù)后[2,3]，這提示AS在腦損傷中的重要作用。G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(G-protein-coupled receptor kinase 5，GRK5)是一類絲蘇氨酸激酶，是GRK家族中的一員，在動物體內(nèi)分布廣泛，有研究發(fā)現(xiàn)，GRK5在體內(nèi)缺陷可增加阿爾茨海默病動物海馬內(nèi)的病理改變，可增加小鼠腦內(nèi)的β-淀粉樣蛋白的生成[4,5]；GRK5表達(dá)沉默可引起AS的活化，而正常表達(dá)可抑制AS活化相關(guān)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[6]，但GRK5對AS凋亡及機(jī)制研究的還未清楚。因此，本研究通過抑制或過表達(dá)GRK5，檢測其對AS凋亡及L-1β和TNF-α表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒及流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；RT-PCR試劑盒上海生工；GRK5、p53、STAT3和磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)抗體均購自美國ABcam公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物及AS培養(yǎng) 出生3 d內(nèi)的SPF級SD大鼠，雌雄不限，購自延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院；無菌條件下取出大鼠大腦皮質(zhì)，通過機(jī)械吹打分散細(xì)胞，逐步取上清液中的單細(xì)胞，離心，獲取沉淀，DMEM培養(yǎng)液(含胎牛血清)吹打使之成為單細(xì)胞懸液(錐蟲藍(lán)計數(shù)細(xì)胞存活率為90%)，以不低于105/cm2密度接種細(xì)胞于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于含5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中在37℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長滿瓶底時用胰酶消化后傳代，傳代3次即可得到純化的AS，AS的鑒定采用間接免疫熒光法檢測GFAP，GFAP是陽性細(xì)胞即為AS，免疫熒光染色顯示AS陽性率達(dá)95%左右。

1.2.2抑制或過表達(dá)GRK5轉(zhuǎn)染AS 參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明分別將干擾GRK5表達(dá)的siRNA(GRK5-siRNA)及GRK5的過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-GRK5)分別轉(zhuǎn)染AS，并同時轉(zhuǎn)染陰性對照組(NC-siRNA)及pcDNA3.1組，細(xì)胞不經(jīng)特殊處理的為空白對照組，收集轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞用于實驗研究。

1.2.3Western blot 細(xì)胞中加入按照1∶100混合的PMSF溶液和RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉后孵育一抗，其中GRK5、p53、STAT3和p-STAT3抗體按照1∶500稀釋，內(nèi)參GAPDH按照1∶1 000稀釋，洗膜后孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)，常溫孵育1 h，洗膜，ECL工作液顯色，暗室中顯影定量。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞分為四組：(1)對照組：培養(yǎng)的AS無任何處理；(2)缺氧組：細(xì)胞在1%的O2、5%的CO2及94%的N2混合氣體中培養(yǎng)24 h；(3)缺氧+pcDNA3.1-GRK5組：在缺氧處理前24 h 加入pcDNA3.1-GRK5；(4)缺氧+GRK5-siRNA組：在缺氧處理前24 h加入GRK5-siRNA。各組細(xì)胞處理至規(guī)定時間后利用Annexin V-FITC/PI標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。具體步驟參照試劑盒說明。

1.2.5活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)含量檢測 收集已處理至規(guī)定時間的各組細(xì)胞，加入PBS洗滌，胰蛋白酶消化，離心棄上清，加入1 ml的2′,7′-二氯二氫熒光素黃二乙酸酯(DCFH-DA)重懸細(xì)胞，37℃避光30 min，再次離心后棄上清，PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)2次此操作，流式細(xì)胞儀檢測。由于檢測的熒光強(qiáng)度與ROS水平呈現(xiàn)出正相關(guān)，所以用此可間接反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.6IL-1β和TNF-α表達(dá)檢測 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，使用20 μl的反應(yīng)體系通過熒光定量PCR儀進(jìn)行IL-1β和TNF-α的擴(kuò)增。其中IL-1β、TNF-α的引物分別為TNF-α:上游引物5′-CCAACAAGGAGGAGAAGTTCC-3′,下游引物5′-CTCTGCTTGGTGGTTTGCTAC-3′;IL-1β:上游引物5′-GGAACCCGTGTCTTCCTAAAG-3′,下游引物5′-CTGACTTGGCAGAGGACAAAG-3′。PCR反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃終延伸10 min，最后4℃保存。

2 結(jié)果

2.1GRK5在轉(zhuǎn)染的AS中的表達(dá) 將GRK5-siRNA和pcDNA3.1-GRK5分別轉(zhuǎn)染AS，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中GRK5蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，空白組、siRNA-NC組、GRK5-siRNA組、pcDNA3.1-組和pcDNA3.1-GRK5組GRK5的蛋白表達(dá)分別為0.215±0.024、0.228±0.026、0.063±0.009、0.220±0.025、0.667±0.068，經(jīng)單因素方差分析，5組GRK5蛋白的比較差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=118.150,P=0.000)，組間兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，siRNA-NC組和pcDNA3.1組GRK5的表達(dá)與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，GRK5-siRNA組GRK5的表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)，pcDNA3.1-GRK5組GRK5的表達(dá)顯著高于空白組(P<0.05)。

2.2GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測抑制或過表達(dá)GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS凋亡的影響，結(jié)果如圖2所示，空白組、缺氧組、缺氧+pcDNA3.1-GRK5組和缺氧+GRK5-siRNA組的細(xì)胞凋亡率分別為(1.25±0.23)%、(4.18±0.56)%、(2.02±0.41)%、(7.63±0.71)%，4組的細(xì)胞凋亡率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=94.274,P=0.000)；與空白組比較，缺氧組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+pcDNA3.1-GRK5組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，缺氧+GRK5-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.3GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS中ROS水平的影響 以流式細(xì)胞儀檢測的各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度衡量細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，檢測結(jié)果如圖3所示，空白組、缺氧組、缺氧+pcDNA3.1-GRK5組和缺氧+GRK5-siRNA組ROS水平分別為59.62±4.13、91.38±6.22、70.15±5.16、122.43±7.47，各組ROS水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.676,P=0.000)；缺氧組ROS水平顯著高于空白組(t=66.676，P=0.000)，缺氧+pcDNA3.1-GRK5組ROS水平顯著低于缺氧組(P<0.05)，缺氧+GRK5-siRNA組ROS水平顯著高于缺氧組(P<0.05)。

2.4GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS中IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測各組細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，空白組、缺氧組、缺氧+pcDNA3.1-GRK5組和缺氧+GRK5-siRNA組IL-1β的表達(dá)分別為1、6.785±0.741、3.224±0.554、10.127±1.123；TNF-α的表達(dá)分別為1、2.774±0.263、1.262±0.201、5.262±0.687;3組IL-1β的表達(dá)和TNF-α的表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F1=50.659，P1=0.000，F(xiàn)2=63.133，P2=0.000)；與空白組比較，缺氧組IL-1β和TNF-α的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+pcDNA3.1-GRK5組IL-1β和TNF-α的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，缺氧+GRK5-siRNA組IL-1β和TNF-α的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

2.5GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS中凋亡蛋白及STAT3信號通路的影響 空白組、缺氧組、缺氧+pcDNA3.1-GRK5組和缺氧+GRK5-siRNA組p53的蛋白表達(dá)分別為0.114±0.015、0.292±0.035、0.163±0.018、0.547±0.063；STAT3的蛋白表達(dá)分別為0.368±0.042、0.347±0.046、0.350±0.044、0.364±0.048；p-STAT3的蛋白表達(dá)分別為0.031±0.007、0.120±0.013、0.053±0.009、0.234±0.031，4組p53蛋白表達(dá)和p-STAT3蛋白表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F1=78.478，P1=0.000，F(xiàn)2=79.254，P2=0.000)，而4組的STAT3的蛋白表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.157,P=0.922)；與空白組比較，缺氧組p53和p-STAT3的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+pcDNA3.1-GRK5組p53和p-STAT3的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，缺氧+GRK5-siRNA組p53和p-STAT3的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見圖5。

圖1 GRK5在轉(zhuǎn)染的AS的表達(dá)Fig.1 Expression of GRK5 in transfected astrocytesNote:A.Western blot was used to detect the protein expression of GRK5;B.The relative expression of GRK5 protein in the cells of each group;compared with the blank group,*.P<0.05.

圖2 GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS凋亡的影響Fig.2 Effect of GRK5 on apoptosis of astrocytes through hypoxia inductionNote:A.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of each group;B.The rate of apoptosis in each group;compared with the blank group,*.P<0.05;compared with the hypoxia group,#.P<0.05.

圖3 GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS中ROS水平的影響Fig.3 Effect of GRK5 on ROS level of astrocytes through hypoxia inductionNote:Compared with the blank group,*.P<0.05;compared with the hypoxia group,#.P<0.05.

圖4 GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS中IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of GRK5 on IL-1β and TNF-α expression of astrocytes through hypoxia inductionNote:Compared with the blank group,*.P<0.05;compared with the hypoxia group,#.P<0.05.

圖5 GRK5對缺氧誘導(dǎo)的AS中p53、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of GRK5 on p53,STAT3 and p-STAT3 protein expression of astrocytes through hypoxia inductionNote:A.The results of Western blot detection;B.The relative expression of p53,STAT3 and p-STAT3 protein;1.Blank group;2.Hypoxia group;3.Hypoxia+pcDNA3.1-GRK5 group;4.Hypoxia+siRNA-GRK5 group;compared with the blank group,*.P<0.05;compared with the hypoxia group,#.P<0.05.

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，AS不僅可保護(hù)和支持神經(jīng)元，且可參與神經(jīng)元突觸形成和軸突生長調(diào)節(jié)，腦損傷后可引起AS功能及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響神經(jīng)的康復(fù)[7,8]。缺氧、缺血是繼發(fā)腦損傷的一個常見因素，可增加AS活性[9,10]。GRK5為一類絲蘇氨酸激酶，在多種與神經(jīng)紊亂有關(guān)的疾病中發(fā)揮作用[11]。有研究顯示，敲除GRK5的小鼠在老化時β-淀粉樣蛋白生成量增多，引起炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[12]。沉默GRK5的表達(dá)可刺激NF-κB表達(dá)，增加AS的活化[13]，GRK5對AS細(xì)胞凋亡的影響怎樣目前還未清楚。本研究中抑制或過表達(dá)GRK5，并通過缺氧處理，試圖檢測GRK5表達(dá)的改變對AS的影響。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧可引起AS的凋亡，而過表達(dá)GRK5可降低AS的凋亡，抑制GRK5的表達(dá)反之，這提示GRK5表達(dá)的升高可能對腦損傷起到保護(hù)作用。

大量研究顯示，多種炎癥因子，如TNF-α等的分泌可使AS活化，AS的活化在損傷早期可加快TNF-α和IL-1β等致炎因子的釋放，進(jìn)而加重炎癥變化，在多項研究中發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β可增加AS的凋亡[14,15]。本研究檢測抑制或過表達(dá)GRK5后對缺氧誘導(dǎo)的AS中TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧可增加TNF-α和IL-1β表達(dá)，過表達(dá)GRK5可降低TNF-α和IL-1β表達(dá)，而抑制GRK5表達(dá)后TNF-α和IL-1β表達(dá)升高，這提示GRK5表達(dá)升高可減輕炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡受到多種途徑的影響，如細(xì)胞內(nèi)ROS含量及一些凋亡因子等。ROS的堆積過度可引起蛋白質(zhì)的氧化損傷，細(xì)胞的代謝、功能和結(jié)構(gòu)的異常等，最終將導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死，神經(jīng)細(xì)胞死亡的一個關(guān)鍵因素就是細(xì)胞內(nèi)的ROS含量增多[16,17]。p53為一個凋亡促進(jìn)因子，研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠p53后可降低癲癇導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，AS中p53的表達(dá)增強(qiáng)可引起細(xì)胞凋亡[18,19]。本研究檢測GRK5引起AS凋亡的途徑，發(fā)現(xiàn)缺氧可引起ROS含量和p53增加，過表達(dá)GRK5可降低ROS含量和p53表達(dá)，抑制GRK5表達(dá)反之。這提示GRK5可通過調(diào)節(jié)ROS含量和p53表達(dá)影響AS的凋亡。STAT3信號通路是一個重要的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程，缺氧、癲癇、炎癥刺激等多種因素均可激活腦內(nèi)的STAT3，受到刺激后STAT3發(fā)生磷酸化[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的活化可增加AS的反應(yīng)性增生，抑制STAT3信號可對腦損傷起到保護(hù)作用[23]。本研究的結(jié)果顯示，缺氧可誘導(dǎo)磷酸化的STAT3表達(dá)，而對STAT3表達(dá)無影響，過表達(dá)GRK5可抑制磷酸化的STAT3表達(dá)，抑制GRK5表達(dá)可增強(qiáng)磷酸化的STAT3表達(dá)。這提示GRK5可通過下調(diào)STAT3信號影響AS。

綜上所述，過表達(dá)GRK5可降低AS凋亡及ROS水平，下調(diào)L-1β、TNF-α、p53表達(dá)及STAT3信號通路，抑制GRK5表達(dá)反之。本研究可能為腦損傷的分子靶向治療提供了新的方法，值得進(jìn)一步從體內(nèi)實驗進(jìn)行驗證。