蘇書娟

(南陽醫(yī)專一附院,南陽 473000)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居世界第二位[1]。目前對于肝癌的治療主要是以腫瘤切除術(shù)為主[2]。但由于肝癌發(fā)病較晚，且具有較高的轉(zhuǎn)移率，導(dǎo)致僅有不足20%的患者適合手術(shù)治療[3,4]。放療是治療癌癥的常用方法，但常規(guī)的放療對惡性肝癌無效[5]。因此，尋找新的藥物提高肝癌的放療敏感性是延長晚期肝癌患者生存時間的關(guān)鍵。牡荊葡基黃酮(Vitexin glucolone,VG)是一類天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗癌等藥理學(xué)活性。研究表明，VG能抑制食道癌、前列腺癌、卵巢癌等多種癌細胞增殖[6,7]。VG還能通過抑制自噬誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，并有抑制肝癌血管新生的活性[8,9]。但VG對肝癌細胞的放療敏感性的影響還未見報道。因此，本文將探討VG對人肝癌細胞放療敏感性的作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶購自美國Gibco公司。VG購自美國Santa Cruz公司。CCK8試劑盒購自中國碧云天科技公司。流式細胞儀購自美國BD公司，X射線儀購自英國Philips公司。B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶1(Transfer growth factor activated kinase,TAK1)、腺氨酸活化蛋白激酶α1(Adenosine monophosphateactivated protein kinase α1,AMPKα1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)抗體均購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞Huh7購自美國ATCC公司。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 將Huh7細胞培養(yǎng)于6孔板中，隨機分為si-Ctrl組和si-TAK1組。待細胞匯合率達到80%以上時，si-TAK1組加入TNK1 siRNA(si-TAK1)-Lipofectamine 3000復(fù)合體轉(zhuǎn)染48 h，si-Ctrl組用不含TAK1序列的siRNA-Lipofectamine 3000復(fù)合體進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染成功后，再將si-Ctrl組和si-TAK1組分為Control組、VG(40 μmol/L)組、Radiation組和Radiation+ VG組，進行后續(xù)實驗。實驗所用到的si-TAK1和siRNA均由上海生工生物工程公司設(shè)計合成。

1.2.3放療 將細胞分為Control組、VG(40 μmol/L)組、Radiation組和Radiation+ VG組。VG(40 μmol/L)組和Radiation+ VG組給予VG(40 μmol/L)處理24 h，其余兩組給予等量溶媒。24 h后用X射線機對Radiation組和Radiation+ VG組細胞進行照射，照射劑量率為0.465 Gy/min，運行條件為100 kVp，5 mA。Control組和VG(40 μmol/L)組則正常培養(yǎng)。照射后將細胞重新放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，以進行后續(xù)實驗。

1.2.4CCK8檢測細胞活性 將細胞傳代接種于96孔板中，并用含有不同濃度VG的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。24 h后每孔加入10 μl CCK8試劑繼續(xù)孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測吸光度。

1.2.5流式檢測細胞凋亡 放射和VG處理細胞后，用預(yù)冷的PBS清洗細胞3次，0.25%胰酶收集細胞，隨后加入Annexin V緩沖液重懸沉淀并加入FITC標(biāo)記的Annexin V抗體和PI避光室溫孵育30 min，最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6Western blot 用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，隨后加入5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h。封閉完成后，棄去封閉液，加入適應(yīng)濃度一抗(Bcl-2 1∶900;Bax 1∶1 000;TAK1 1∶1 000;AMPKα1 1∶1 000;PPARγ 1∶1 200)，于4℃封閉過夜。第二天滴加二抗室溫封閉1 h，最后加入ECL顯色液曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1放療及VG對肝癌細胞活性的影響 為了解VG對肝癌細胞增殖活性的影響，我們用不同濃度VG處理細胞并檢測各組細胞活性。實驗結(jié)果表明，與Control組比較，Radiation組肝癌細胞存活率明顯降低(P<0.05，圖1)；與Radiation組比較，VG(20 μmol/L)組和VG(40 μmol/L)組細胞存活率進一步降低(P<0.05，圖1)。

2.2VG對放療促肝癌細胞凋亡作用的影響 為了探討VG對放療促肝癌細胞凋亡作用的影響，我們選擇對Huh7活性抑制作用最強的VG(40 μmol/L)和放療聯(lián)合作用于細胞，并檢測細胞凋亡情況。實驗結(jié)果表明，與Control組比較，VG(40 μmol/L)組和Radiation組肝癌細胞的凋亡率均顯著升高(P<0.05，圖2)；與Radiation組比較，Radiation+ VG 組細胞凋亡率也明顯升高(P<0.05，圖3)。此外，VG(40 μmol/L)和放療還能明顯促進Bax表達，抑制Bcl-2表達，從而降低Bax/Bcl-2的比值(P<0.05，圖3)；VG和放療聯(lián)合作用較單獨放療比較,肝癌細胞Bax/Bcl-2的比值進一步升高(P<0.05，圖3)。

2.3VG 對放療調(diào)控TAK1/AMPK通路作用的影響 為了探究VG增強人肝癌細胞的放射敏感性的作用機制，我們用Western blot法檢測TAK1/AMPK通路的蛋白表達情況。TAK1/AMPK信號通路是調(diào)控細胞增殖、凋亡及自噬的重要信號通路[11]。實驗結(jié)果表明，VG(40 μmol/L)和放療均可明顯促進通路蛋白TAK1、AMPKα1和PPARγ的表達(P<0.05，圖4)；與單獨放療比較，VG和放療聯(lián)合處理細胞能進一步顯著上調(diào)TAK1、AMPKα1和PPARγ的表達水平(P<0.05，圖4)。

圖1 VG對肝癌細胞活性的影響Fig.1 Effect of VG on cell viability of hepatoma carcinoma cellsNote:A.The chemical formula of VG;B.The cell viability of Huh7 cells was measured by CCK8 assay.*.P<0.05,#.P<0.01 versus Control group.

2.4抑制TAK1/AMPK通路激活對VG增強肝癌細胞放療敏感性作用的影響 為了進一步探究VG增強肝癌細胞放療敏感性作用與TAK1/AMPK通路的關(guān)系，我們采用siRNA沉默TAK1的表達。與Control組比較，si-TAK1組細胞TAK1表達水平明顯降低，表明轉(zhuǎn)染成功(P<0.01，圖5)；沉默TAK1表達后，與Control組比較，VG(40 μmol/L)組肝癌細胞存活率和細胞凋亡率無顯著性變化(P>0.01，圖5)；Radiation組與Control組比較細胞存活率明顯降低，細胞凋亡率也明顯升高(P<0.05，圖5)；與Radiation組比較，Radiation+ VG 組肝癌細胞存活率和凋亡率均無明顯變化(P>0.01，圖5)，表明沉默si-TAK1明顯反轉(zhuǎn)了VG促肝癌細胞凋亡和抑制肝癌細胞活性的作用。

圖2 VG對放療促肝癌細胞凋亡作用的影響Fig.2 Effect of VG on induction effect of radiotherapy on cell apoptosis of hepatoma carcinoma cellNote:Cell apoptosis was determined by flow cytometry.*.P<0.05 versus Control group;#.P<0.05 versus Radiation group.

圖3 VG對放療促肝癌細胞凋亡蛋白表達作用的影響Fig.3 Effect of VG on effects of radiotherapy on apoptosis-related proteins of hepatoma carcino-ma cellNote:A.The expressions of Bcl-2 and Bax were measured by Western blot;B.The quantification of protein.β-actin was used as loading control.*.P<0.05 versus Control group, #.P<0.05 versus Radiation group.

圖4 VG 對放療調(diào)控TAK1/AMPK通路作用的影響Fig.4 Effect of VG on regulative effect of radiotherapy on TAK1/AMPK signaling pathwayNote:A.The protein levels of TAK1, AMPKα1 and PPARγ were measured by Western blot;B.The quantification of protein levels.*.P<0.05 versus Control group;#.P<0.05 versus Radiation group.

圖5 抑制TAK1/AMPK通路激活對VG增強肝癌細胞放療敏感性作用的影響Fig.5 Effect of inactivation of TAK1/AMPK pathway on effect of VG on hepatoma carcinoma cell radiosensitivityNote:A.The expression of TAK1 was measured by Western blot;B.The quantification of TAK1,**.P<0.01 versus si-Ctrl group;C.Cell viability was measured by CCK8 assay;D.Cell apoptosis was determined by flow cytometry.*.P<0.05 versus Control group;#.P<0.05 versus Radiation group.

3 討論

近年來研究表明，天然產(chǎn)物具有較強的抗癌活性[10]。VG是一類天然黃酮類化合物，常被用于治療哮喘、咳嗽等疾病，并且也具有較強的抗癌活性[7]。研究表明，VG的抗癌作用與調(diào)控癌細胞的增殖和凋亡有關(guān)。VG可誘導(dǎo)食管癌、白血病及乳腺癌等癌細胞的凋亡[6,11,12]。本研究實驗結(jié)果表明，VG可顯著抑制人肝癌細胞Huh7的活性，誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡，表明其具有抗肝癌作用，這也與之前的研究報道一致[8]。放療是治療癌癥的常用方法，其能通過誘導(dǎo)癌細胞死亡、氧化應(yīng)激及細胞周期阻滯等抑制癌癥的發(fā)展[13-15]。我們的研究也表明放療可顯著抑制肝癌細胞活性，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。癌細胞對放療的不敏感性是限制放療應(yīng)用的重要因素，其中以肝癌最突出[3,16]。研究表明，多類天然藥物可增強肝癌細胞的放療敏感性。羽扁豆醇可通過增強肝癌細胞的放療敏感性促進癌細胞凋亡，抑制腫瘤生長[17]。黃連素可通過Nrf2/ROS信號通路調(diào)控癌細胞氧化應(yīng)激增強肝癌細胞對放療的敏感性[18]。但VG是否具有放療增敏作用還未見報道。本文研究發(fā)現(xiàn)，VG可明顯增強放療促肝癌細胞凋亡及上調(diào)Bax/Bcl-2比值的作用。Bcl-2是一類抗凋亡蛋白，其能結(jié)合到線粒體膜上以抑制細胞色素C的表達，從而抑制細胞凋亡[19]。Bcl-2還可通過下調(diào)caspase-3活性抑制細胞凋亡[20]。Bax則是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子，在調(diào)控腫瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[21]。實驗結(jié)果表明，VG可通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達增強放療促肝癌細胞凋亡的作用，表明VG可增強肝癌細胞放療敏感性。

AMPK 信號通路主要參與細胞生長、自噬和細胞代謝的調(diào)控[22]。研究表明，AMPK激活可誘導(dǎo)多種應(yīng)激條件下的細胞凋亡[23,24]?？梢种聘伟┘毎鲋?、誘導(dǎo)肝癌細胞周期阻滯而減緩癌癥的發(fā)展[22]。TAK1是AMPK信號通路的上游調(diào)控分子。TAK1抑制劑可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的AMPK通路的激活，上調(diào)TAK1表達又可通過促進AMPK的激活促進心肌細胞凋亡[25]。mTORC1是AMPK的下游效應(yīng)分子。Mathieu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1可通過調(diào)控PPARγ的表達調(diào)控脂肪細胞的活性。PPARγ是脂質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)酶，同時還能抑制多種癌癥的發(fā)展[27]。研究表明，VG也可通過AMPK通路誘導(dǎo)細胞自噬[28]。本研究實驗結(jié)果表明，VG可顯著促進TAK1、AMPK和PPARγ的表達，VG還可增強放療對TAK1、AMPK和PPARγ表達的促進作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默TAK1可反轉(zhuǎn)VG對細胞活性的抑制作用及對細胞凋亡的促進作用，顯著減弱VG增強放療促細胞凋亡和抑制細胞增殖活性的作用，提示VG增強肝癌細胞放療敏感性與激活TAK1/AMPK通路有關(guān)。

綜上所述，VG可增強放療對肝癌細胞活性的抑制作用及對肝癌細胞凋亡的促進作用，并且其機制與調(diào)控TAK1/AMPK通路激活有關(guān)。本研究可能為提高肝癌放療敏感性提供了一種新的方法，為放療應(yīng)用于肝癌的治療提供了新的可能性。因為TAK1/AMPK通路也是調(diào)控細胞自噬的經(jīng)典通路之一，因此，在后期實驗中我們將繼續(xù)探討VG通過TAK1/AMPK通路增強肝癌細胞放療敏感性與自噬的關(guān)系。