姜 華 王維強 魏桂花

(成都市第三人民醫(yī)院麻醉科，成都 610031)

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，是一種世界性的健康問題[1]。在我國，糖尿病在20歲以上的成年人中發(fā)病率可達9.7%，并且約有15.5%的人處于糖尿病發(fā)病前期[2]。心血管疾病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因[3]。研究表明，糖尿病患者通常都伴有心臟收縮及舒張功能障礙、心肌肥大和纖維化，并易發(fā)展為冠心病和充血性心力衰竭，最終導致患者死亡[4]。糖尿病不僅能導致內(nèi)皮功能紊亂和動脈粥樣硬化，也能導致直接的心肌損傷[5]。研究表明，氧化應激在糖尿病誘導的心肌損傷的過程中起重要作用，活性氧的大量產(chǎn)生可直接導致大量心肌細胞凋亡，最終導致心力衰竭[6]。因此，有效抑制氧化應激和心肌細胞凋亡是緩解糖尿病心血管疾病的關鍵。目前對于心血管疾病的治療主要是采用手術恢復冠脈血流，但糖尿病會增加術后患者復發(fā)及死亡的風險[7]。科羅索酸(Corosolic acid,CA)是從紫薇中提取的一類五環(huán)三萜化合物，具有腫瘤、抗炎、抗氧化及抗糖尿病活性，并且還能減輕糖尿病誘導的肺損傷[8]。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是臨床常用麻醉藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗焦慮功效[9]。已有研究表明，DEX能減輕心肌缺血損傷，但尚不足以影響心肌缺血預后[10,11]。CA和DEX聯(lián)合用藥是否能增強DEX抗糖尿病誘導的心肌損傷還未見報道。本文采用鏈尿佐菌素 (Streptozotocin,STZ)復制大鼠糖尿病模型，探究CA對DTX緩解糖尿病心肌損傷的作用的影響。

1 材料與方法

1.1材料 CA購自上海純優(yōu)公司，分子式為C30H48O4，分子量為472.7，純度≥98%，DEX購自江西恒瑞醫(yī)藥有限公司(批號：12071033)；STZ購自美國Sigma公司；高脂飼料購自武漢亞法生物技術公司(批號：040508)；肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)、肌酸激酶同工酶 (Creatine kinase MB,CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I (Cardiac troponin I,cTnI)購自上海紀寧生物科技公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 和丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α,TNF-α) 和白介素-6 (Interleukin-6,IL-6)以及Ki67和Caspase-3一抗，兔抗小鼠二抗均購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型復制 60只雄性SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，體重220～300 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-24。將大鼠隨機分為對照(Control,Ctrl)組、STZ組、CA組、DEX組和CA+DEX組。將大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，除Ctrl外，其余組腹腔注射STZ(60 mg/kg)，Ctrl組則腹腔注射相同體積的生理鹽水。注射STZ 7 d后取空腹血檢測空腹血糖，空腹血糖>7.8 mmol/L的大鼠視為造模成功。自復制模型成功起，每天腹腔注射給予DEX (20 μg/kg)和CA (20 mg/kg)，連續(xù)7 d。

1.2.2組織及血液樣品準備 給予CA和DEX 7 d后，給予大鼠過量的10%水合氯醛處死大鼠，并立即打開胸腔暴露心臟，用注射器于右心室抽取血液，取左心室并分為2份，一份用4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，另一份-80℃儲存，用于Western blot實驗。

1.2.3HE染色檢測心肌組織病理損傷 取石蠟切片，用二甲苯脫蠟后，加入乙醇(濃度由高到低)進行處理。用蒸餾水沖洗5 min后，加入蘇木精染色 5 min。用流水沖洗未結合的蘇木精，用0.5%的鹽酸酒精進行分色，水洗藍化8 s后，用乙醇脫水。隨后加入伊紅染色液染色30 s，再次用乙醇脫水，最后用二甲苯透明，用樹脂封片后于生物顯微鏡下觀察心肌組織病變情況。

1.2.4試劑盒檢測心功能及氧化應激相關指標 將大鼠血液于室溫靜置1 h后，4℃ 35 000 r/min離心15 min，去上層血清根據(jù)試劑盒說明書檢測血清Mb、CK-MB、cTnI、SOD和MDA的濃度。

1.2.5Western blot檢測細胞增殖及凋亡 用RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。10%SDS-PAGE分離各組蛋白質(zhì)，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%的牛血清白蛋白室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，2 h后更換為適宜濃度的一抗，于4 ℃封閉過夜。第二天用緩沖液洗去未結合一抗，加入二抗室溫孵育1 h后，滴加化學發(fā)光顯色液，于暗室曝光顯影。用Image J對蛋白質(zhì)條帶進行半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.6ELISA檢測炎癥因子的表達 取血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF-α和IL-6的濃度。

2 結果

2.1CA對DEX緩解糖尿病大鼠心肌病理損傷作用的影響 如圖1所示，Ctrl組大鼠心肌組織無明顯病理變化。STZ組大鼠心肌細胞排列紊亂、斷裂，細胞核出現(xiàn)固縮，有中到重度水腫及炎性細胞的浸潤，表明造模成功；CA和DEX組心肌細胞紊亂、斷裂程度與STZ組比較有所減輕，有輕度水腫及炎性細胞浸潤，DEX組核固縮明顯減少。CA+DEX組心肌細胞排列基本整齊，核固縮明顯減少，基本無細胞斷裂及水腫，表明CA能增強DEX緩解糖尿病大鼠心肌損傷的作用。

2.2CA對DEX增強糖尿病大鼠心臟功能作用的影響 與Ctrl組比較，STZ組大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的濃度顯著升高，表明造模成功 (P<0.01，圖2)；與STZ組比較，DEX組模型大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的濃度明顯降低 (P<0.01，圖2)，CA組大鼠血清cTnI的濃度也明顯低于STZ組 (P<0.01，圖2)；與DEX組比較，CA+DEX組模型大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的濃度進一步降低 (P<0.01，圖2)，表明CA能增強DEX促進糖尿病大鼠心臟功能恢復的作用。

圖1 CA對DEX緩解糖尿病大鼠心肌病理損傷作用的影響Fig.1 Effect of CA on DEX alleviating myocardial injury of diabetic ratsNote:n=8.Myocardial injury was visualized by HE staining.

圖2 CA對DEX促進糖尿病大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI分泌的影響Fig.2 Effects of CA on promotive effect on secretion of Mb,CK-MB and cTnI by DEXNote:The concentration of Mb,CK-MB and cTnI were detected by kits.Each experiment was repeated at least three times.n= 8,**.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs STZ group；&&.P<0.01 vs DEX group.

2.3CA對DEX抗心肌氧化應激作用的影響 與Ctrl組比較，STZ組糖尿病大鼠血清SOD濃度明顯降低(P<0.01，圖3)，MDA濃度明顯升高 (P<0.01，圖3)；與STZ組比較，CA組和DEX組血清SOD濃度明顯升高、MDA濃度明顯降低(P<0.01，圖3)；CA+DEX組大鼠血清SOD濃度與DEX組比較明顯升高、MDA濃度明顯降低(P<0.01，圖3)，表明CA能增強DEX抗糖尿病大鼠心肌組織氧化應激的作用。

2.4CA對DEX抗心肌細胞凋亡作用的影響 Western blot實驗結果表明，STZ組大鼠心肌組織Ki67的蛋白表達水平明顯降低 (P<0.01，圖4)，Caspase-3表達水平明顯升高 (P<0.01，圖4)，與Ctrl組比較差異具有統(tǒng)計學意義；CA和DEX能顯著促進糖尿病大鼠心肌組織Ki67的表達，抑制Caspase-3表達 (P<0.01，圖4)；CA+DEX組大鼠心肌組織Ki67表達水平與DEX組比較明顯升高 (P<0.01，圖4)，Caspase-3表達水平與DEX組比較顯著降低 (P<0.01，圖4)，表明CA能增強DEX對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用。

圖3 CA對DEX抗氧化應激作用的影響Fig.3 Effect of CA on anti-oxidative stress of DEXNote:n= 8,**.P<0.01 vs Ctrl group;##.P<0.01 vs STZ group;&&.P<0.01 vs DEX group.

圖4 CA對DEX抗心肌細胞凋亡作用的影響Fig.4 Effect of CA on anti-apoptosis effect of DEX in myocardiumNote:GAPDH was used as loading control,n=8,**.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs STZ group；&&.P<0.01 vs DEX group.

圖5 CA對DEX抗炎作用的影響Fig.5 Effect of CA on anti-inflamatory effect of DEXNote:n=8,**.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs STZ group；&&.P<0.01 vs DEX group.

2.5CA對DEX抗炎作用的影響 ELISA實驗結果表明，與Ctrl組比較，STZ組大鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6的含量明顯增多(P<0.01，圖5)；與STZ組比較，CA組和DEX組糖尿病大鼠血清TNF-α和IL-6的分泌量顯著減少 (P<0.01，圖5)；與DEX組比較，CA+DEX組大鼠血清TNF-α和IL-6的濃度顯著降低 (P<0.01，圖5)，表明CA能增強DEX的抗炎作用。

3 討論

大量研究表明，CA具有降血糖、抗糖尿病活性，被認為是最具抗糖尿病潛力的藥物之一[12]。同時CA還能通過抑制心肌細胞凋亡和抗氧化應激對抗異丙腎上腺素誘導的心肌損傷[13]，但CA對糖尿病誘導的心肌損傷的作用還未見報道。本文研究采用高脂飼料聯(lián)合STZ誘導糖尿病心肌損傷模型，并腹腔注射給予CA發(fā)現(xiàn)，CA能增強心肌功能、抑制心肌組織氧化應激和心肌細胞凋亡，從而減輕心肌組織損傷。DEX是臨床常用麻醉藥物，已有大量研究證明DEX有明確的心肌保護作用，能夠通過抑制心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應，對抗缺血再灌注引起的心肌組織損傷，也能減輕糖尿病誘導的心肌缺血損傷[10,14]。本文研究也發(fā)現(xiàn)，DEX能減輕STZ誘導的糖尿病大鼠心肌組織病理損傷，增強大鼠心功能，還能減輕心肌組織氧化應激、細胞凋亡及炎癥反應。同時，CA還能顯著增強DEX對心肌組織氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應的抑制作用，增強DEX促糖尿病大鼠心肌功能恢復的作用。

心血管疾病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，據(jù)統(tǒng)計，約有75%的糖尿病患者都有心血管疾病并發(fā)癥[15]。雖然在糖尿病誘發(fā)心血管疾病早期沒有明顯的癥狀，但在發(fā)病早期進行干預有利于降低糖尿病心血管病的死亡率。研究表明，心臟功能的降低常伴有Mb、CK-MB和cTnI分泌的增多。本文研究也發(fā)現(xiàn)，STZ誘導的糖尿病大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的濃度明顯升高，同時HE染色表明，STZ能明顯造成大鼠心肌組織損傷，提示造模成功。研究表明，CA具有較強的降糖作用[12]。CA能顯著增強DEX緩解糖尿病大鼠心肌組織病理損傷和抑制Mb、CK-MB和cTnI分泌的作用，表明CA能增強DEX的心肌保護作用。

研究表明，氧化應激是導致糖尿病心血管疾病心肌損傷的主要機制之一，過量活性氧的產(chǎn)生和抗氧化酶表達的減少是誘導氧化應激的主要原因[16]?；钚匝蹩芍苯訉е戮€粒體膜通透性增減，使分子量小于1.5 kD的物質(zhì)進入線粒體，導致線粒體膜腫脹、能量供應障礙，直至線粒體膜被完全破壞，細胞色素C進入細胞質(zhì)，啟動細胞凋亡途徑，導致心肌細胞凋亡，最終導致心力衰竭[17-19]。Yamaguchi等[20]研究發(fā)現(xiàn)CA能減輕代謝綜合征大鼠的氧化應激反應。本文研究發(fā)現(xiàn)，CA能顯著增加糖尿病大鼠血清抗氧化酶SOD的濃度，降低血清氧化產(chǎn)物MDA濃度，表明CA具有抗糖尿病大鼠氧化應激的作用。同時CA還能顯著增強DEX對SOD表達的促進作用和對MDA分泌的抑制作用，表明CA能增強DEX抗糖尿病大鼠心肌組織氧化應激的作用。

心肌細胞凋亡是導致心臟功能衰竭的直接原因，抑制心肌細胞凋亡有利于減輕糖尿病誘導的心肌損傷[21,22]。Caspase家族是細胞凋亡的最終執(zhí)行者。研究表明，Caspase-3在糖尿病誘導的心肌梗死模型大鼠心肌中表達明顯增多，Caspase-3表達水平的上調(diào)能促進心血管疾病的發(fā)展[23]。在糖尿病誘導的心血管疾病早期，氧化應激可通過激活線粒體Caspase-3信號通路誘導心肌細胞凋亡[24]。本文研究表明，CA能顯著抑制糖尿病大鼠心組織Caspase-3表達，并能促進細胞增殖標記蛋白Ki67表達，表明CA能抑制心肌細胞凋亡、促進心肌細胞增殖。此外，CA還能增強DEX抑制Caspase-3表達和促進Ki67表達的作用，表明CA能增強DEX抗心肌細胞凋亡的作用。

炎癥反應是導致糖尿病大鼠心肌損傷的另一重要機制。研究表明，促炎因子的表達和心肌組織氧化應激呈正相關，炎癥因子可通過減弱心肌細胞收縮能力和生存能力導致左心室功能的衰減[25,26]。白楊素可通過抑制TNF-α表達減輕心肌組織炎癥反應，從而減輕糖尿病誘導的心肌損傷[27]。本文研究還發(fā)現(xiàn)，CA還能顯著降低糖尿病模型大鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6濃度，提示CA具有抗炎活性，與之前的報道一致[28]。同時，CA還能增強DEX抑制TNF-α和IL-6表達的作用，表明CA能增強DEX的抗炎活性，從而減輕糖尿病大鼠心肌損傷。

綜上所述，CA和DEX均能增強STZ誘導的糖尿病大鼠心臟功能、減輕氧化應激、心肌細胞凋亡和炎癥反應，從而減輕心肌損傷，CA還能增強DEX對糖尿病大鼠心臟功能、心肌組織氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應的調(diào)控作用，從而增強DEX對糖尿病大鼠的心肌保護作用。本文首次探究了CA對糖尿病誘導的心肌損傷的作用，并發(fā)現(xiàn)CA能增強DEX的心肌保護作用，為糖尿病誘導的心血管病的治療提供了一種新的潛在聯(lián)合用藥方案。