鄭宏毅 鄭永唐

(中國科學(xué)院昆明動物研究所,昆明 650223)

鄭宏毅，2010年畢業(yè)于安徽醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)，同年考入中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院攻讀碩士和博士學(xué)位，師從中國科學(xué)院昆明動物研究所鄭永唐研究員，2016年獲細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)理學(xué)博士學(xué)位?，F(xiàn)為中國科學(xué)院昆明動物研究所博士后。主要從事非人靈長類艾滋病動物模型和免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究。

鄭永唐，中國科學(xué)院昆明動物研究所，中國科學(xué)院動物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員、博士生導(dǎo)師，現(xiàn)任中國科學(xué)院昆明動物研究所生物安全三級實(shí)驗(yàn)室主任。中國免疫學(xué)會常務(wù)理事、云南省免疫學(xué)會秘書長、云南省微生物學(xué)會副理事長。Zool Res副主編，Cell Mol Immunol、Chin J Nat Med等學(xué)術(shù)期刊編委。2017年國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎二等獎(第二位)、2003年獲云南省自然科學(xué)獎二等獎(第一位)，2008年獲云南省科技進(jìn)步獎一等獎(第一位)。主要從事艾滋病免疫學(xué)和靈長類動物模型研究。至今在PNAS、Mol Biol Evol、Nat Commun,Nucleic Acids Res、AIDS、J Immunol、Eur J Immunol、Cell Mol Immunol等SCI收錄期刊發(fā)表論文270篇。

人類疾病動物模型構(gòu)建是研究疾病發(fā)生機(jī)理和發(fā)展醫(yī)藥學(xué)治療手段的重要方法，在實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有不可替代的作用。非人靈長類動物(Non-human primate,NHP)由于與人具有最接近的基因背景和表型特征，能夠更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和應(yīng)用于防治措施研究，因而也是連接基礎(chǔ)研究與臨床醫(yī)學(xué)之間的橋梁。靈長目動物包含有16科72屬300余種，而應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的非人靈長類動物主要是舊大陸猴，其中以獼猴、平頂猴和食蟹猴為主，最近新大陸的普通狨猴也常用作動物模型。雖然它們在總實(shí)驗(yàn)動物中的比例不足1%，卻是許多重大疾病，尤其是感染性疾病和神經(jīng)精神性疾病最合適甚至是唯一的模型動物，代表著國際研究熱點(diǎn)與前沿。目前非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物主要應(yīng)用于腦功能、認(rèn)知和神經(jīng)-精神性疾病、生殖發(fā)育、兒童健康、干細(xì)胞研究和傳染性疾病機(jī)制與疫苗研發(fā)等。例如，亞洲獼猴就是最合適的艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)模型動物，在艾滋病發(fā)病機(jī)制、疫苗和藥物研究方面發(fā)揮了極其重要的作用。不難發(fā)現(xiàn)在這些研究領(lǐng)域中免疫病理和免疫治療往往起到重要作用，例如退行性疾病、自身免疫疾病、母胎屏障和感染性疾病等。因此，非人靈長類動物模型對于我們深入理解人類免疫學(xué)特征和疾病的免疫學(xué)機(jī)制具有舉足輕重的作用，我們應(yīng)當(dāng)在免疫學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中充分利用好非人靈長類動物。

1 嚙齒類動物模型在免疫學(xué)研究中遭遇瓶頸

人類疾病的研究需要動物模型，缺乏合適動物模型則是許多重大疾病研究的關(guān)鍵瓶頸?，F(xiàn)在應(yīng)用的動物模型在生理和解剖層面上與人非常相似，從小鼠到猴子這樣的實(shí)驗(yàn)動物都和人具有相同的器官和系統(tǒng)，并且以幾乎相同的方式執(zhí)行相同的功能[1]。其中由于體型小、繁殖快、飼養(yǎng)成本低和便于標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的優(yōu)勢，以小鼠和大鼠為代表的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物一直是構(gòu)建動物模型的首要選擇，為人類戰(zhàn)勝疾病發(fā)揮重要的作用。在108項(xiàng)獲得生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎的諾貝爾獎中，有73項(xiàng)直接依靠嚙齒類動物研究，而像猩猩和猴子這樣的靈長類大動物只為18項(xiàng)提供支持(https://fbresearch.org/medical-advances/nobel-prizes/)。然而我們也要認(rèn)識到2億1千萬年前人和鼠類就已從共同祖先產(chǎn)生進(jìn)化分歧，人和小鼠基因組的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域相似程度只有85%，而非編碼區(qū)域相似度僅有50%，在非編碼RNA研究越來越深入的今天，很可能會刷新兩者遺傳差距的原有認(rèn)知[2]。

在醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究中，使用嚙齒類動物研究表明治療安全有效之后，超過80%的潛在治療藥物在人體中測試失敗。例如分別由輝瑞和強(qiáng)生公司聯(lián)合投資以及禮來公司獨(dú)自投資超過10億美元的兩種阿爾茲海默癥單抗藥物Bapineuzumab和Solanezumab在進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)后慘遭失敗，前者甚至還造成血管性腦水腫與腦溝積液等不良反應(yīng)[3]。2014年Nature雜志的一篇評論引起人們反思鼠類模型研究出的是“老鼠藥”，許多不可重現(xiàn)的臨床前結(jié)果會導(dǎo)致臨床試驗(yàn)中浪費(fèi)大量醫(yī)療資源[4]。在免疫學(xué)的研究過程中，嚙齒類動物的研究結(jié)果也出現(xiàn)了很多問題。首先人類在生命過程中接觸各種病原體，病原體驅(qū)動的選擇過程塑造了人類的免疫系統(tǒng)，而實(shí)驗(yàn)常用的SPF級小鼠卻無法完成這種免疫改造，其基礎(chǔ)免疫應(yīng)答與人有很大的不同[5]。黏膜免疫系統(tǒng)占人體淋巴組織50%以上，是抵抗微生物入侵的主要屏障，而小鼠與人的黏膜免疫系統(tǒng)卻有很大不同，包括形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫細(xì)胞的分布，此外還有微生物菌群的差異，造成了小鼠黏膜免疫系統(tǒng)研究的局限性[6]。由于體型、壽命和自然選擇的影響，小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育、發(fā)生與衰老與人具有顯著性的差異，決定了嚙齒類動物很難用于人類疫苗研究，并且解釋免疫學(xué)數(shù)據(jù)時需要謹(jǐn)慎[7]。人源化小鼠一定程度上能夠解決這些問題，并已成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要臨床前工具，但仍面臨不能完全支持人類淋巴和髓系細(xì)胞發(fā)育、體液免疫應(yīng)答受損和移植物抗宿主病等困難[8]。

2 非人靈長類動物免疫學(xué)研究的發(fā)展

為了突破嚙齒類動物模型在免疫學(xué)研究中的局限性，非人靈長類動物在免疫學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。在過去的100多年中，靈長類動物在免疫學(xué)研究中一直扮演重要角色，除了是人類免疫系統(tǒng)研究的重要實(shí)驗(yàn)動物，也是發(fā)現(xiàn)疾病免疫病理和免疫治療手段的關(guān)鍵動物模型。例如在20世紀(jì)50年代以前，就已經(jīng)利用靈長類動物診斷和治療傷寒、開發(fā)黃熱病和脊髓灰質(zhì)炎疫苗、治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。80年代后由于AIDS和HIV的發(fā)現(xiàn)，獼猴AIDS模型得到長足發(fā)展?；陟`長類動物模型發(fā)現(xiàn)齊多夫定早期治療能夠預(yù)防HIV感染、證明了替諾福韋能夠高效治療HIV感染以及HIV感染的母親可以生下健康的嬰兒。靈長類動物也為器官移植排斥反應(yīng)、炭疽疫苗和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療發(fā)揮重要作用。進(jìn)入21世紀(jì)，獼猴作為多種感染性疾病的治療與疫苗開發(fā)的動物模型已經(jīng)成為共識，在最近的寨卡病毒、埃博拉病毒、中東呼吸綜合征(Middle east respiratory syndrome,MERS)、非典型肺炎(Severe acute respiratory syndromes,SARS)、流感大流行的研究中發(fā)揮重要作用(圖1)[9-11]。

正是由于這些感染性疾病的動物模型創(chuàng)建和研究，非人靈長類動物的免疫學(xué)研究得到發(fā)展。例如猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)感染的亞洲獼猴模型促進(jìn)了HIV感染的黏膜免疫病理研究，發(fā)現(xiàn)獼猴與人有非常相似的黏膜免疫系統(tǒng)，在與微生物移位(Microbial translocation)的相互作用過程中引發(fā)系統(tǒng)性的免疫缺陷癥狀[12]。在靈長類慢病毒的研究過程中，固有免疫系統(tǒng)得以重新認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)了多種宿主抗病毒限制因子，如TRIM5、APOBEC3G、BST-2、SAMHD1、Mx2等。靈長類慢病毒及宿主免疫系統(tǒng)研究已被證明是理解固有免疫進(jìn)化的關(guān)鍵，有助于理解免疫系統(tǒng)的生物學(xué)意義[13]。

圖1 免疫學(xué)研究常用的體內(nèi)和體外模型優(yōu)缺點(diǎn)比較Fig.1 Comparison of commonly used in vivo and in vitro models for immunological studies

除了感染性疾病，研究免疫系統(tǒng)的重要意義還在于免疫系統(tǒng)的衰退往往會影響其他器官系統(tǒng)，誘發(fā)其他組織與器官的慢性病變，如自身免疫性疾病、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征、癌癥等。獼猴模型能夠自然地反映人類中同樣的疾病情形，而嚙齒類模型需要經(jīng)過基因改造才能發(fā)生[14]。此外，靈長類實(shí)驗(yàn)動物在受控的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，排除了多種依從性和風(fēng)險(xiǎn)行為(如使用非法藥物、吸煙、酗酒)的干擾，還可用于需要重復(fù)抽樣的縱向觀察，非常適合慢性疾病的研究[15]。多年來對靈長類動物退行性疾病的研究促進(jìn)了免疫衰老機(jī)制的發(fā)展，在老齡化加速的現(xiàn)代社會具有重要的研究價(jià)值。

3 非人靈長類動物免疫學(xué)的研究現(xiàn)狀

由于體型大、使用成本高昂和動物倫理上的限制，非人靈長類動物至今很少用于基礎(chǔ)免疫學(xué)的研究，絕大多數(shù)應(yīng)用于臨床前研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中又有很大一部分用于醫(yī)藥公司的研發(fā)而無法公開，因而相對于嚙齒類動物缺乏許多生物學(xué)基礎(chǔ)關(guān)鍵數(shù)據(jù)。根據(jù)以上特點(diǎn)我們主要從免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制和免疫功能特征的角度來介紹非人靈長類動物的免疫學(xué)研究發(fā)展情況(表1)，而一些研究，如器官移植更偏向于臨床和藥物研究，腫瘤免疫學(xué)更傾向于使用小動物，就不在本文中敘述了。

3.1感染免疫 非人靈長類動物模型用于超過70多種人類感染性疾病的研究：包含多樣的致病原，如細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲和朊病毒；多種感染病類型，如全球性感染性疾病、兒童感染病、熱帶感染病、性傳播疾病、新發(fā)感染病、人畜共患病、潛在的生物恐怖主義、傳染性海綿狀腦病、致瘤性傳染病以及其他傳染病[70]。其中最具獨(dú)特價(jià)值的是應(yīng)用于AIDS的研究。SIV感染亞洲獼猴的CD4+淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生接近于AIDS的疾病特征，該模型促進(jìn)了AIDS免疫病理的研究[71,72]。Brenchley等[16]觀察SIV感染獼猴發(fā)現(xiàn)黏膜組織是病毒感染的主要位點(diǎn)，在感染的極早期就會引起胃腸道黏膜的病理變化，因而微生物的脂多糖、肽聚糖、遺傳物質(zhì)等進(jìn)入血液循環(huán)誘發(fā)系統(tǒng)性的免疫活化，CD4+細(xì)胞在旁觀者效應(yīng)作用下大量死亡。此后，Klatt等[48]用抗病毒藥物和益生菌/益生元的聯(lián)合療法治療SIV感染的平頂猴，發(fā)現(xiàn)動物的胃腸道免疫力得以提高，減少了結(jié)腸淋巴濾泡纖維化，促進(jìn)了CD4+細(xì)胞的重建。非洲綠猴和烏白眉猴是SIV的天然宿主，能夠感染SIV并維持高水平的病毒血癥卻不發(fā)病，對這類非致病動物模型的研究更新了對AIDS的認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)急性感染后的免疫活化、病毒在中央記憶性CD4細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的復(fù)制以及病毒基因產(chǎn)物(Nef、Vpu、Vpx等)與宿主免疫系統(tǒng)相互作用是引發(fā)AIDS的必要條件[64,73,74]。近年來對AIDS靈長類動物模型局部免疫的研究，發(fā)現(xiàn)次級淋巴組織濾泡CD8+T細(xì)胞在控制病毒復(fù)制過程中起到關(guān)鍵作用，為AIDS的治療提供了新的免疫學(xué)依據(jù)[17]。我們實(shí)驗(yàn)室首次創(chuàng)建了HIV-1感染北平頂猴艾滋病模型，HIV-1可在北平頂猴體內(nèi)呈低水平持續(xù)性復(fù)制和形成潛伏感染，用潛伏激活劑JQ1和Prostratin可以激活靜息性CD4+T細(xì)胞內(nèi)HIV-1的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)干擾素相關(guān)基因在控制北平頂猴中的HIV-1感染中起重要作用，為HIV的免疫學(xué)研究和治療提供了較為理想的模型[48, 49]。

表1常用非人靈長類動物在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用

Tab.1Applicationofcommonlyusednon-humanprimatesinimmunologystudies

動物種類研究方向參考文獻(xiàn)獼猴感染免疫艾滋病[16,17](Macaca mulatta)結(jié)核病[18,19]埃博拉[20-22]寨卡[23]中東呼吸綜合征[24]非典型肺炎[25]流感[26]免疫應(yīng)答固有免疫[27-32]適應(yīng)性免疫[33-38]免疫衰老固有免疫[39-42]適應(yīng)性免疫[43-45]自身免疫性疾病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[46]系統(tǒng)性紅斑狼瘡[47]北平頂猴感染免疫艾滋病[48,49](Macaca leonina)免疫衰老適應(yīng)性免疫[50]南平頂猴感染免疫艾滋病[51](Macaca nemestrina)流感[52]免疫應(yīng)答天然免疫[53]適應(yīng)性免疫[54]自身免疫性疾病自身免疫性糖尿病[55]食蟹猴感染免疫結(jié)核病[56-58](Macaca fascicularis)埃博拉[22]非典型肺炎[59]流感[60]自身免疫性疾病自身免疫性貧血[61]慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎[62]自身免疫性卵巢疾病[63]非洲綠猴感染免疫艾滋病[64](Cercopithecus aethiops)非典型肺炎[65]免疫應(yīng)答適應(yīng)性免疫[66]普通狨猴自身免疫性疾病自身免疫性腦脊髓炎[67,68](Callithrix jacchus)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[69]

食蟹猴和獼猴模型被用于結(jié)核分枝桿菌(Tuberculous bacillus,TB)感染和結(jié)核病研究已有超過50年的歷史。這些動物模型與人的臨床表現(xiàn)非常相似，可以通過檢測與人體幾乎相同的參數(shù)來監(jiān)測疾病過程[75]。靈長類動物結(jié)核病模型主要用于結(jié)核疫苗評估，瑞典傳染病控制研究所使用獼猴模型發(fā)現(xiàn)結(jié)合載體rAD35的重組卡介苗AFRO-1可誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答[18]。荷蘭萊斯韋克靈長類生物醫(yī)學(xué)研究中心通過使用氣管內(nèi)接種的獼猴模型評估新型疫苗的保護(hù)能力[19]。了解TB感染的免疫病理有助于進(jìn)一步開發(fā)和改進(jìn)治療策略。Lin等[56]發(fā)現(xiàn)相對于潛伏型TB感染模型，活動型TB感染食蟹猴模型的肺中有更多的CD4+和CD8+T細(xì)胞，并且其PBMC、支氣管肺泡灌洗液和縱隔淋巴結(jié)中的IFN-γ水平更高。Green等[57]使用食蟹猴模型檢測了Treg細(xì)胞在活動型TB中的作用，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在炎癥反應(yīng)增加的情況下發(fā)生，而不是作為疾病進(jìn)展的致病因子。使用TNF-α中和劑治療被證實(shí)會增加結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)，潛伏型TB感染的食蟹猴模型在使用TNF中和劑治療后重新激活感染，并且會出現(xiàn)和原發(fā)性結(jié)核類似的肉芽腫結(jié)構(gòu)[58]。

埃博拉病毒是近年來關(guān)注度極高的烈性致病微生物。Caballero等[20]觀察埃博拉感染獼猴模型發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈的固有免疫反應(yīng)可能是發(fā)病的主要原因。埃博拉病毒感染初期在巨噬細(xì)胞中復(fù)制，誘使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞因子反應(yīng)，這種促炎細(xì)胞因子的失調(diào)被認(rèn)為是埃博拉出血熱免疫病理的核心[76]。埃博拉病毒出血熱患者和獼猴模型的IFN-α血漿濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他病毒感染，甚至達(dá)到100倍，但是IFN-β的產(chǎn)生卻很少[21]。Smith等[22]用IFN-β對埃博拉病毒和馬爾堡病毒感染獼猴及食蟹猴模型進(jìn)行早期暴露后治療，顯著增加了動物的存活時間，也增加了馬爾堡病毒感染后的存活時間。自2015年起，寨卡病毒在美洲快速蔓延，新生兒小頭癥病例激增，這與寨卡病毒感染導(dǎo)致胎兒生長受限和胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形有關(guān)。Hirsch等[23]用寨卡病毒感染懷孕的獼猴，發(fā)現(xiàn)病毒感染引起的母體-胎盤-胎兒炎癥反應(yīng)影響發(fā)育過程中胎兒的氧氣輸送，揭示了寨卡病毒感染的免疫病理與胎兒發(fā)育異常之間的潛在關(guān)系。

3.2免疫應(yīng)答 清楚不同靈長類(包括人)的免疫應(yīng)答究竟有何異同對疫苗研發(fā)有重要的參考價(jià)值。多年來的研究表明靈長類在面對病原體感染時的免疫應(yīng)答并不相同，雖然艾滋病、瘧疾和癌癥每年在世界各地造成數(shù)百萬人死亡，但幾種非人類靈長類動物卻能夠天然地受到保護(hù)。例如黑猩猩可以感染HIV但很少進(jìn)展為AIDS，并且對鐮狀瘧原蟲瘧疾感染免疫，多數(shù)非人類靈長類動物的癌癥發(fā)病率也低于在人類中所觀察到的[77]。Barreiro等[78]使用LPS刺激人類、黑猩猩和獼猴的原代單核細(xì)胞，通過基因表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)核心免疫反應(yīng)基因在三者之間高度保守，但人類特異性免疫應(yīng)答富集了涉及細(xì)胞凋亡的基因以及與癌癥生物學(xué)相關(guān)的基因，這表明人類的免疫應(yīng)答控制能力可能天然就比其他靈長類動物要弱。

對于天然免疫系統(tǒng)，非人靈長類與人十分相似，而與嚙齒類有很大不同。Ketloy等[27]發(fā)現(xiàn)獼猴的血液樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)以及單核細(xì)胞來源的DC (monocyte-derived dendritic cell,MDDC)表達(dá)與人類相同的TLR，但與小鼠DC亞群基本不同，并且通過上調(diào)CD40和CD86的表面表達(dá)來響應(yīng)4種TLR對應(yīng)的激動劑。Chung等[28]發(fā)現(xiàn)獼猴漿細(xì)胞樣DC與人一樣為CD123+HLA-DR+譜系，組成型高表達(dá)干擾素調(diào)節(jié)因子-7 (Interferon regulatory factor,IRF-7)，并在單純皰疹病毒刺激后表達(dá)IFN-α、TNF-α、CCL4和CXCL10。針對DC的免疫治療在獼猴模型中也同樣有效，人Flt-3L同樣能夠使獼猴體內(nèi)DC的數(shù)量增加10～12倍，對于改進(jìn)DC靶向疫苗策略以預(yù)防病毒感染具有重要意義[29]。獼猴的自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell,NK)與人有些不同，循環(huán)的大多數(shù)NK細(xì)胞(> 85%)是CD16單陽性的，但都表達(dá)CD8α和NKG2A/C抗原[79]。非人靈長類NK細(xì)胞免疫應(yīng)答的資料多數(shù)來自于AIDS動物模型研究領(lǐng)域。Reeves等[30]發(fā)現(xiàn)獼猴CD16+NK細(xì)胞表達(dá)高水平的細(xì)胞溶解分子，CD56+NK細(xì)胞主要是分泌細(xì)胞因子，SIV感染則驅(qū)動獼猴NK細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生減少而細(xì)胞毒性增加以及從次級淋巴器官向外周轉(zhuǎn)運(yùn)。Wang等[31]發(fā)現(xiàn)SHIV感染的獼猴黏膜NKp44+NK細(xì)胞的IL-22分泌能力下降，從而引發(fā)微生物移位。Shang等[32]對雌性獼猴進(jìn)行陰道接種SIV病毒，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞募集到黏膜部位在1周達(dá)到峰值，第2周迅速減少，膜NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和MIP-1α，但缺乏一些活化和細(xì)胞毒性標(biāo)志物。

針對特定病原體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答在疫苗研究中尤為重要，非人靈長類動物提供了很多難以在人和嚙齒類動物上獲得的數(shù)據(jù)。獼猴B祖細(xì)胞在骨髓中經(jīng)歷重排和表達(dá)BCR的過程產(chǎn)生初始B細(xì)胞，初始B細(xì)胞被抗原活化后經(jīng)過一系列的增殖、同種型轉(zhuǎn)換(從IgM 到IgG、IgA或者IgE)和高頻突變過程分化為記憶性B細(xì)胞[80]。同人B細(xì)胞一樣，獼猴B細(xì)胞在刺激后上調(diào)CD80、CD86和CD40表達(dá)，并且分泌多種細(xì)胞因子[33]。Phuah等[81]發(fā)現(xiàn)食蟹猴結(jié)核模型的肉芽腫內(nèi)含有高度活化和增殖的B細(xì)胞，并且產(chǎn)生高水平的結(jié)核分枝桿菌特異性IgG，在組織中控制局部感染。Lu等[34]研究雌性獼猴月經(jīng)周期內(nèi)的B細(xì)胞免疫，發(fā)現(xiàn)雌激素刺激CD8+T細(xì)胞表達(dá)高水平的IFN-γ和IL-12，這些細(xì)胞控制黏膜和濾泡中的B細(xì)胞分泌活性。Pichyangkul等[35]使用H1N1感染的非人靈長類動物模型，發(fā)現(xiàn)H1N1感染后誘導(dǎo)局部T和B細(xì)胞反應(yīng)，大量的病毒特異性CD8+T細(xì)胞存在于肺組織中并表達(dá)CD103和CD69，而分泌特異性抗體的記憶性B細(xì)胞主要存在于縱膈淋巴結(jié)。

T細(xì)胞應(yīng)答的功效依賴于MHC等位基因的數(shù)量，多個MHC等位基因可以提供大量潛在的T細(xì)胞識別肽庫。人類有3個MHC-Ⅰ類基因座(HLA-A、B和C)和3個MHC-Ⅱ類基因座(HLA-DP、DQ和DR)，獼猴有2個MHC-Ⅰ類基因座(A和B)和3個MHC-Ⅱ類基因座(DP、DQ、DR)[82]。與人類不同，獼猴在每條染色體上可能有幾個MHC-Ⅰ等位基因，并且可能發(fā)生顯著的交叉，導(dǎo)致單倍型多樣性增加[83]。IL-7和MHC信號通過低水平的穩(wěn)態(tài)增殖維持初始T細(xì)胞的存活，記憶T細(xì)胞不需要MHC接觸來存活但需要IL-7和IL-15[84]。獼猴的IL-7和IL-15基因與人類和嚙齒類同源物具有高度的遺傳性(96%)和功能同源性[85]。Villinger等[36]使用破傷風(fēng)和流感疫苗免疫獼猴，隨后注射IL-2或者IL-15加強(qiáng)免疫，發(fā)現(xiàn)IL-15加強(qiáng)了抗病毒記憶T細(xì)胞的數(shù)量和IFN-γ水平。對SIV感染的獼猴模型用重組獼猴IL-7治療能夠誘導(dǎo)初始和中央記憶T細(xì)胞的增殖，而在抗病毒治療中使用IL-15可以促進(jìn)效應(yīng)記憶性CD4+T細(xì)胞的特異性恢復(fù)[86]。

非人靈長類模型還有助于發(fā)現(xiàn)不同病原體獨(dú)特的T細(xì)胞應(yīng)答模式。Mooij等[37]發(fā)現(xiàn)人類和獼猴對HIV-1抗原(Gag、Pol、Nef和Env)的T細(xì)胞應(yīng)答高度相似，都能夠引發(fā)持續(xù)的抗原特異性CD4+和CD8+細(xì)胞因子反應(yīng)。Li等[66]使用呼吸道合胞病毒感染幼年非洲綠猴，發(fā)現(xiàn)病毒感染誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答而CD4+T細(xì)胞應(yīng)答水平很低，并且支氣管肺泡灌洗液中病毒特異性CD8+T細(xì)胞水平比外周血高10倍。與小鼠不同，非人靈長類具有和人類相似的CD8+T細(xì)胞表型與功能，例如都表達(dá)能夠呈遞結(jié)核分枝桿菌脂質(zhì)抗原的CD1和細(xì)胞毒素/殺菌蛋白顆粒溶素[87]。Chen等[38]將獼猴體內(nèi)CD8+T細(xì)胞用抗體剔除后再接種卡介苗，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致抗結(jié)核病免疫能力顯著降低，并且對已經(jīng)感染結(jié)核和抗生素治療的獼猴剔除CD8+T細(xì)胞也是同樣的結(jié)果。

3.3免疫衰老 如同其他器官系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)也會表現(xiàn)出特有的衰老特征，各種免疫細(xì)胞組分在表型和功能上均產(chǎn)生了不同程度的變化，導(dǎo)致了老年人比青年人更具易感性，這一過程稱之為免疫衰老[88]。隨著全球老齡化問題越來越嚴(yán)重，近年來非人靈長類動物常被用于免疫衰老的研究。其中研究最多的是T細(xì)胞。類似于人類T淋巴細(xì)胞衰老，獼猴衰老過程中也經(jīng)歷了相似的變化，如初始T細(xì)胞進(jìn)行性減少和向記憶性表型轉(zhuǎn)變，尤其是向CD28-CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)變[43]，同時伴隨胸腺退化、穩(wěn)態(tài)增殖水平的提高，表現(xiàn)為老年獼猴初始T細(xì)胞BrdU插入和Ki67表達(dá)水平上調(diào)[39]。近期研究顯示靈長類動物T細(xì)胞的衰老類似于人類，但有物種差異。Cicin-Sain等[40]和Jankovic等[43]的研究表明老年印度獼猴初始T細(xì)胞亞群的減少在CD4+與CD8+T細(xì)胞中沒有差異，并在老年組中發(fā)現(xiàn)CD4+中央記憶性T細(xì)胞比例和CD8+效應(yīng)記憶性T細(xì)胞比例顯著升高。不同于人類CD4/CD8比值隨年齡增長進(jìn)行性降低的過程，印度獼猴的CD4/CD8比值在出生后2個月就開始從比值約為2左右降低，直到5至7歲不再降低，之后不再有明顯變化[44]。而中國獼猴的CD4/CD8比值和初始T細(xì)胞數(shù)量卻跟人非常相似，隨年齡增長而進(jìn)行性降低，并且雄性的T細(xì)胞衰老要快于雌性[45]。

盡管B細(xì)胞的表型變化在SIV/SHIV獼猴模型中進(jìn)行了多方面的研究，但在獼猴免疫衰老研究中還未引起廣泛重視，有少數(shù)證據(jù)表明老年獼猴(>18歲)的CD27+B細(xì)胞比例比成年獼猴(5～10歲)有顯著增加[14]。獼猴淋巴細(xì)胞衰老過程中的功能變化仍未了解清楚，但有研究表明其類似于人類的免疫衰老過程。Mascarucci等[41]使用LPS和PHA刺激獼猴的PBMC，檢測上清細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)IL-10和IL-6的產(chǎn)出表現(xiàn)為與年齡相關(guān)的增長效應(yīng)，而IFN-γ在老年獼猴的PBMC中產(chǎn)出降低，IL-1β和TNF-α的產(chǎn)出沒有年齡相關(guān)性。Jankovic等[43]使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)比較了不同年齡獼猴的T細(xì)胞IFN-γ與TNF-α的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)主要是CD8+效應(yīng)記憶性T細(xì)胞隨年齡增長產(chǎn)出增加，此外發(fā)現(xiàn)老年獼猴的T細(xì)胞體外增殖活性減弱。老年獼猴的呼吸道上皮細(xì)胞在LPS的刺激下表達(dá)更高水平的IL-6和IL-8，表現(xiàn)出一種炎性衰老(Inflamm-aging)特征，這會提高病毒靶細(xì)胞的水平，進(jìn)而引發(fā)更為致病的感染[42]。Josset等[89]使用2009年甲型H1N1流感病毒株感染年輕與老年獼猴，發(fā)現(xiàn)老年獼猴的病毒復(fù)制水平更高并伴隨強(qiáng)烈的炎癥、天然免疫相關(guān)基因的表達(dá)和CD4+效應(yīng)T細(xì)胞減少，表明老年獼猴的適應(yīng)性免疫和天然免疫衰老皆加強(qiáng)了流感病毒感染致病性。我們實(shí)驗(yàn)室研究老年AIDS中國獼猴模型發(fā)現(xiàn)免疫衰老和天然免疫調(diào)控失衡是老年AIDS發(fā)病更快的主要原因，在研究新型AIDS動物模型北平頂猴的過程中發(fā)現(xiàn)其具有和人十分相似年齡相關(guān)免疫學(xué)變化，可以為免疫衰老和老年AIDS的研究提供重要契機(jī)[50, 90]。

3.4自身免疫性疾病 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型是人類自身免疫疾病研究最深入的動物模型，不僅被用作多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)的特定模型，還是研究最廣泛的人類自身免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病通用動物模型[91]。在EAE研究中最常用的非人靈長類動物包括獼猴、食蟹猴和普通狨猴，三者都對EAE敏感，但狨猴模型在臨床和病理學(xué)表現(xiàn)中最接近人的MS[92]。Zaguia等[67]的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞攻擊MS損傷位點(diǎn)的少突膠質(zhì)細(xì)胞，表明細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)腦和脊髓的白質(zhì)與灰質(zhì)脫髓鞘。EAE狨猴模型提供的證據(jù)表明這些強(qiáng)致病性T細(xì)胞可能來源于巨細(xì)胞病毒特異的效應(yīng)記憶性T細(xì)胞庫，在MS的致病機(jī)制中起到重要作用。此外，EAE狨猴模型還揭示了B細(xì)胞γ1皰疹病毒感染的致病機(jī)制，即這種感染會誘導(dǎo)B細(xì)胞內(nèi)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG) 的免疫顯性表位(40～48位氨基酸序列)免受蛋白水解酶降解，被交叉呈遞到自身反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞從而引起MS。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病。在嚙齒類動物中觀察到的有療效的新療法通常無法在患者測試中重復(fù)結(jié)果[7]，非人靈長類動物有助于彌補(bǔ)這種差距，使用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)獼猴模型發(fā)現(xiàn)了多種致病機(jī)制。Bakker等[46]發(fā)現(xiàn)早期炎性滑膜中存在的T細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎發(fā)作中起重要作用，早期使用T細(xì)胞免疫的強(qiáng)抑制劑環(huán)孢素A可以預(yù)防CIA，而在臨床活動型CIA期間對動物沒有治療效果。獼猴和狨猴RA模型中都發(fā)現(xiàn)膠原特異性抗體，尤其是IgM同種型的膠原特異性抗體在CIA獼猴模型的發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用，這是由于IgM分子的5個可用抗原結(jié)合位點(diǎn)更容易通過Fc受體和C3受體與嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合，然后嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶侵蝕關(guān)節(jié)軟骨表面上的滑液而暴露抗原位點(diǎn)[69]。非人靈長類動物不僅可以作為RA模型研究發(fā)病機(jī)制，Schaal等[93]還在舊大陸猴中發(fā)現(xiàn)一種稱之為θ-防御素1的環(huán)狀肽，能夠抑制致死性炎癥，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有顯著的療效。

4 非人靈長類動物免疫學(xué)研究的應(yīng)用現(xiàn)狀

雖然非人靈長類動物在免疫學(xué)研究中具有非常遠(yuǎn)大的前景，但依然面臨諸多問題。首先大動物價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)成本高，難以進(jìn)行規(guī)模化實(shí)驗(yàn)。普通狨猴個體小、繁殖快、飼養(yǎng)空間小，但相對于舊大陸猴缺乏疾病模型的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；?，更重要的是抗體等免疫學(xué)研究工具要比獼猴少。種群異質(zhì)性程度高，個體差異大是非人靈長類動物實(shí)驗(yàn)難以解決的一個問題，需要動物飼養(yǎng)中心嚴(yán)格進(jìn)行譜系管理。此外還缺乏系統(tǒng)性的基礎(chǔ)免疫學(xué)信息，例如基因、蛋白、代謝產(chǎn)物和信號通路的數(shù)據(jù)，這限制了非人靈長類動物的有效應(yīng)用。此外例如抗體、試劑、靶點(diǎn)藥物、影像設(shè)備等免疫學(xué)研究工具在非人靈長類動物研究領(lǐng)域還遠(yuǎn)不如大小鼠的成熟，研究者無法充分發(fā)揮非人靈長類動物的研究優(yōu)勢。

這些問題在非人靈長類的免疫學(xué)研究發(fā)展中不斷被解決。現(xiàn)今世界范圍內(nèi)的靈長類實(shí)驗(yàn)動物中心都在努力加強(qiáng)靈長類實(shí)驗(yàn)動物的標(biāo)準(zhǔn)化和封閉群建設(shè)，例如依托中科院昆明動物所建設(shè)的“模式動物(靈長類)表型與遺傳研究”國家大科學(xué)設(shè)施獲批在建中，將更加規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化、智能化和自動化。隨著非人靈長類的免疫學(xué)研究越來越多，商業(yè)公司正在積極發(fā)展配套試劑，NIH數(shù)據(jù)庫登記的能用于靈長類動物的商品化單克隆抗體就已超過500種，多種細(xì)胞因子和生長因子等與人通用，磁珠分選、MHC四聚體等工具都已商業(yè)化。針對靈長類動物的實(shí)驗(yàn)如今配有多種多樣的籠具、手術(shù)臺、活檢設(shè)備、影像設(shè)備等，有利于進(jìn)行免疫學(xué)研究。免疫學(xué)上的獨(dú)特優(yōu)勢促使多種重大復(fù)雜人類疾病模型和免疫學(xué)相關(guān)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究(如抗體類藥物和免疫療法等)使用非人靈長類動物，非人靈長類動物的免疫學(xué)研究需求將更加廣闊。

5 對我國非人靈長類動物免疫學(xué)研究的建議

我國是靈長類動物資源較為豐富的國家，隨著生物醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，靈長類動物的養(yǎng)殖和應(yīng)用得到迅速發(fā)展。而此時西方國家因?yàn)閯游镔Y源稀缺、動物保護(hù)主義者反對和應(yīng)用成本過高等多種原因而進(jìn)展緩慢，甚至大幅縮減非人靈長類的研究[94]。我們應(yīng)當(dāng)把握好這個機(jī)遇對靈長類實(shí)驗(yàn)動物和動物模型資助項(xiàng)目加強(qiáng)引導(dǎo)和加大支持力度，對進(jìn)展較好和有潛力的新型動物模型研究給予優(yōu)先資助，同時考慮到探索創(chuàng)建新型非人靈長類動物模型的風(fēng)險(xiǎn)大、失敗率高，應(yīng)適當(dāng)讓考核寬松些。我們要利用中國多樣的靈長類動物資源，發(fā)掘不同靈長類動物的免疫學(xué)應(yīng)用潛力，選擇條件較好、有研究實(shí)力的機(jī)構(gòu)，分類建設(shè)國家級實(shí)驗(yàn)動物研究中心，更為高效地展開非人靈長類動物的免疫學(xué)研究工作。最后，利用非人靈長類動物獲得免疫學(xué)研究上的突破，關(guān)鍵在于多領(lǐng)域、多學(xué)科的人才培養(yǎng)與合作，大型的靈長類動物研究中心更需要多樣的人才，學(xué)科間的交叉才能推動中國免疫學(xué)的發(fā)展。