牛桂言，邵惠芳*，孫 雙,王曉麗，曹麗君，韓 丹，黃五星，許自成

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.湖北省煙草公司襄陽市公司，湖北 襄陽 441000)

打頂是煙葉生產(chǎn)過程中必不可少的栽培措施，但是對于煙株來說打頂屬于一種機(jī)械損傷。它會(huì)使煙株形成氧化脅迫[1]，改變煙株的碳氮代謝[2]，并進(jìn)一步誘導(dǎo)煙堿的合成[3]。煙堿是煙葉的一種重要的化學(xué)成分，同時(shí)也與卷煙制品的吸味和刺激性密切相關(guān)。煙堿過高或過低，均不利于煙葉優(yōu)良品質(zhì)的形成[4]。由于煙田管理不當(dāng)，以及打頂后煙株產(chǎn)生一系列生理變化及氮素的持續(xù)供應(yīng)等原因，常導(dǎo)致煙葉后期貪青晚熟，煙葉煙堿含量過高，煙葉品質(zhì)下降。

鎢酸鈉(Na2WO4)常被作為硝酸還原酶(NR)的抑制劑，主要是由于鎢原子(W)的性質(zhì)與NR的重要組成成分鉬原子類似，而作用相反，因此可以取代NR復(fù)合體中的鉬，從而達(dá)到抑制NR活性的作用[5-6]。目前以鎢酸鈉作為NR抑制劑的研究主要集中在其對葉類蔬菜，如小白菜、油菜等NR活性的調(diào)控以及對硝態(tài)氮含量的影響方面。其中楊榮等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，Na2WO4抑制兩個(gè)供試油菜品種根系NR活性的最佳濃度為1.0 mmol/L，同時(shí)影響根系對氮素的吸收速率。司江英等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，0.8 mmol/L的Na2WO4處理能夠降低小白菜的NR活性以及凈光合速率。同時(shí)周碧燕等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下噴施適量濃度的鎢酸鈉能夠提高茶樹葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和抗氧化酶活性。目前關(guān)于鎢酸鈉對打頂后烤煙形成的氧化脅迫、氮代謝以及對煙堿的調(diào)控尚未報(bào)道。

湖北南漳煙區(qū)煙葉生長后期溫度較低，降雨較多，土壤氮素后期持續(xù)供應(yīng)，導(dǎo)致煙葉成熟度較差，貪青晚熟，煙堿含量過高，不利于煙葉優(yōu)良品質(zhì)的形成，降低工業(yè)可用性。因此，本試驗(yàn)通過對生長過旺的煙葉噴施不同濃度的Na2WO4，研究其對打頂后煙株氮代謝、氧化脅迫及煙堿含量的影響，以期為解決后期煙葉貪青晚熟、提高煙葉品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2016年5～9月于湖北省襄陽市南漳縣薛坪鎮(zhèn)進(jìn)行。南漳位于湖北西北部，試驗(yàn)地薛坪鎮(zhèn)海拔700 m左右，供試品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩NK326。供試土壤為黃壤土，基礎(chǔ)土壤養(yǎng)分狀況為：有機(jī)質(zhì)43.57 g/kg，堿解氮161.53 mg/kg，有效磷29.95 mg/kg，速效鉀282.00 mg/kg，pH值7.34。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，鎢酸鈉噴施濃度分別為0、0.5、1.0、1.5 mmol/L，分別用CK、T1、T2、T3表示。各處理均于煙株打頂當(dāng)天16：00以后進(jìn)行整株葉面噴施，葉背、葉面均勻噴施，每個(gè)處理100株。在打頂當(dāng)天及以后每隔10 d進(jìn)行農(nóng)藝性狀的測定，在打頂當(dāng)天、打頂后1 d及做噴施處理后每隔10 d進(jìn)行煙葉樣品的采集，共取5次，用以對煙葉進(jìn)行生理各項(xiàng)指標(biāo)的測定。煙苗于當(dāng)?shù)?月10日采取井窖式方式進(jìn)行移栽，株距55 cm，行距110 cm，7月21日打頂，單株留葉數(shù)在20～22片左右。試驗(yàn)地田間管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)管理進(jìn)行。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 煙株根系活力的測定

煙株根系活力采用TTC方法測定[10]。

1.3.2 煙葉氮代謝關(guān)鍵酶活性的測定

選取具有代表性的煙株，對中部葉(10～12葉位)進(jìn)行鮮樣的采集。剪取距離葉尖1/3處兩支脈之間鮮煙片，將每個(gè)處理煙樣混合均勻后用鋁箔紙和紗布裹好，迅速置于液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行酶活的測定。硝酸還原酶(NR)采取活體法進(jìn)行測定[11]，谷氨酰胺合成酶(GS)采用分光光度法測定[12]。

1.3.3 煙葉抗氧化酶活性及丙二醛含量的測定

取樣方法與氮代謝酶相同。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑還原法測定[13]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[13]。丙二醛(MDA)的含量采用硫代巴比妥酸法測定[13]。

1.3.4 烤后煙葉煙堿的測定

每個(gè)處理選取烤后煙葉C3F和B2F等級各1 kg，粉碎后過0.25 mm篩。煙堿含量采用比色法測定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行圖、表的制作，運(yùn)用SPSS 21.0進(jìn)行方差分析和多重比較。采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉的調(diào)控效果進(jìn)行綜合評價(jià)。當(dāng)指標(biāo)與調(diào)控效果呈正相關(guān)時(shí)，隸屬函數(shù)的計(jì)算公式為：R(Xi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin);當(dāng)指標(biāo)與調(diào)控效果呈負(fù)相關(guān)時(shí)，隸屬函數(shù)的計(jì)算公式為：R(Xi)=1-(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)。i=1，2，…，n。公式中Xi為i處理某指標(biāo)測定值，Ximin為該指標(biāo)所有處理的最小值；Ximax為該指標(biāo)所有處理的最大值。最后將每處理組所有指標(biāo)的調(diào)控效果的隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加，求其平均數(shù)，值越大代表調(diào)控效果越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鎢酸鈉處理對煙株根系活力的影響

在打頂后的3個(gè)時(shí)期，不同濃度鎢酸鈉處理的煙株根系活力均低于對照處理，同一時(shí)期隨著鎢酸鈉濃度的增加其對根系的抑制作用逐漸增強(qiáng)(表1)。打頂當(dāng)天，與對照相比，不同濃度鎢酸鈉處理的煙株根系活力間無顯著差異；打頂后10 d，T2和T3處理較對照顯著降低，分別降低了21.83%和24.82%；打頂后20 d，T1、T2和T3處理較對照顯著降低，分別較對照降低16.90%、36.00%和41.57%；打頂后30 d，T2和T3處理較對照顯著降低，分別為對照的69.66%和65.25%。

表1 不同濃度鎢酸鈉處理對煙株根系活力的影響 [μg/(g·h)]

注:表中不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到0.05%顯著水平。下同。

2.2 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.2.1 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉NR活性的影響

隨著打頂時(shí)間的推移，NR活性的整體變化規(guī)律表現(xiàn)為先增高后降低，與對照相比，同一時(shí)期隨著鎢酸鈉濃度的增加NR活性顯著下降(表2)。打頂當(dāng)天各處理間無顯著差異；打頂后10 d各處理NR活性達(dá)到最大值，其中T2和T3處理顯著低于對照，較對照分別降低11.34%、17.47%；打頂后20 d，處理T1、T2、T3較對照顯著降低，分別為對照的82.72%、73.55%、64.07%，且此時(shí)期NR活性較上一時(shí)期的降低幅度最大，降幅依次表現(xiàn)為T3(48.14%)>T2(44.59%)>T1(42.75%)>CK(33.20%)；打頂后30 d，各處理NR活性降為最小值，T2、T3處理顯著低于對照，分別較對照降低了29.40%、50.00%。

表2 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉NR活性的影響 [μg/(g FW·h)]

2.2.2 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉GS活性的影響

隨著打頂時(shí)間的推移，GS活性的變化規(guī)律與NR活性的變化規(guī)律表現(xiàn)基本一致，同一時(shí)期，當(dāng)鎢酸鈉濃度為0.5～1.0 mmol/L時(shí)，GS活性隨著鎢酸鈉濃度的增高而顯著降低，當(dāng)濃度增加為1.5 mmol/L時(shí)，GS活性的降低效果不顯著(表3)。其中，打頂當(dāng)天各處理間差異不顯著；打頂后10 d，各處理GS活性達(dá)到最大值，其中處理T2、T3較對照顯著降低，分別為對照的69.05%、67.91%；打頂后20 d，與對照相比，處理T2和T3顯著降低，分別較對照降低了28.62%、34.07%；打頂后30 d各處理的GS活性均降低到最小值，其中處理T2和T3較對照顯著降低，分別較對照降低了39.02%、34.14%。

表3 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉GS活性的影響 [A/(mg Protein·h)]

2.3 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉抗氧化系統(tǒng)的影響

2.3.1 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉SOD活性的影響

打頂后1 d煙葉SOD的活性明顯增加，打頂后10～30 d，各處理SOD活性變化規(guī)律不盡一致。處理CK、T1、T3在打頂后1 d達(dá)到最大值，處理T2在打頂后20 d達(dá)到最大值(圖1)。其中，打頂當(dāng)天各處理間無顯著差異；打頂后1 d SOD活性的增幅較大，以處理T2顯著增加，增長幅度達(dá)到49.32%。在打頂后1 d到打頂后10 d這一時(shí)間段，SOD活性相對較穩(wěn)定，處理T2的SOD活性稍有升高，其他處理則稍有下降。打頂后1、10、20 d，與對照相比，均以處理T2顯著高于對照，分別較對照增加了13.60%、32.69%、37.50%；打頂后30 d各處理SOD活性均下降，處理T2顯著下降，降幅為35.83%。

圖1 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉SOD活性的影響

2.3.2 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉POD活性的影響

隨著打頂時(shí)間的推移，煙葉POD活性表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(圖2)。打頂當(dāng)天，各處理間未達(dá)到顯著差異；打頂后1 d，各處理的POD活性均達(dá)到最大值，處理T2增加較多，增幅達(dá)到19.68%；打頂后10 d，處理T2較對照顯著增加，較對照增加了34.21%；打頂后20 d，處理T1、T2、T3較對照顯著增加，分別較對照增加了20.29%、27.25%、17.39%。在打頂后30 d POD活性降低到最小值，各處理間未達(dá)到顯著差異，此時(shí)期各處理的降幅具體表現(xiàn)為T2(31.30%)>T1(31.19%)>T3(30.39%)>CK(14.85%)。

圖2 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉POD活性的影響

2.3.3 不同濃度鎢酸鈉處理對MDA含量的影響

隨著打頂時(shí)間的推移，MDA含量呈一直增加的趨勢(圖3)。打頂后1 d，處理T1與對照相比顯著降低，較對照降低了17.11%；打頂后10～20 d，MDA含量均以處理T2最低，與對照相比差異顯著，較對照分別降低了26.59%、26.85%，且這兩個(gè)時(shí)期間MDA含量差異較小，變化幅度不超過5%；打頂后30 d MDA含量達(dá)到最大值，比打頂當(dāng)天增加了將近1倍，與對照相比，處理T3的MDA顯著降低，較對照降低了13.40%。

2.4 不同濃度鎢酸鈉處理對不同部位煙堿含量的影響

噴施不同濃度的鎢酸鈉的上、中部位煙葉的煙堿含量均低于對照，且鎢酸鈉的濃度越高煙堿含量越低(圖4)。與對照相比，不同濃度的鎢酸鈉處理的上部葉煙堿含量均顯著低于對照，分別是對照的77.06%、61.77%、54.43%。同時(shí)，與對照相比，中部葉煙堿含量以處理T2、T3顯著低于對照，較對照分別降低了37.62%、41.91%。

圖3 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉MDA含量的影響

圖4 不同濃度鎢酸鈉處理烤后不同部位煙葉煙堿含量

2.5 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉各項(xiàng)指標(biāo)的綜合評價(jià)

采用模糊隸屬法對噴施不同濃度的鎢酸鈉的煙葉各項(xiàng)指標(biāo)的變化進(jìn)行綜合性評價(jià)，計(jì)算各指標(biāo)其隸屬函數(shù)值，然后求各處理平均隸屬函數(shù)值，其平均隸屬函數(shù)值越大，代表其調(diào)控效果越好。不同處理對烤煙成熟期各項(xiàng)指標(biāo)調(diào)控效果最好的是T2處理，具體表現(xiàn)為T2>T3>T1>CK(表4)。

表4 不同濃度鎢酸鈉處理對煙葉各項(xiàng)指標(biāo)的綜合評價(jià)

3 討論與結(jié)論

煙株的前期生長主要以氮代謝為主，這有助于煙株的生長發(fā)育和干物質(zhì)的積累，打頂后煙株碳氮代謝發(fā)生轉(zhuǎn)變，有利于煙葉生長后期的成熟和品質(zhì)的形成[15]。NR和GS是煙株氮代謝的關(guān)鍵酶，它們的大小在一定程度上是氮代謝強(qiáng)弱的直接反映[16-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施Na2WO4能夠顯著減弱NR的活性，這與黃海濤等[18]、楊榮等[7]的研究結(jié)果一致。同時(shí)Na2WO4減弱了打頂后生長過旺煙株的根系活力，這與周萬海等[19]在研究鎢酸鈉對苜蓿根系生長的結(jié)果一致。說明Na2WO4能在一定程度上抑制煙株的氮代謝和根系活力，有利于減緩打頂后生長過旺的煙株對氮素的持續(xù)利用，防止煙株過分的貪青晚熟。

在煙草打頂以后會(huì)使煙株產(chǎn)生氧化脅迫，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，來阻止氧化脅迫對自身細(xì)胞的毒害。目前已經(jīng)利用轉(zhuǎn)基因的方法，來減少氧化脅迫的危害[20-21]。通常情況下，植株遭受氧化脅迫時(shí)，主要通過對抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)控來應(yīng)對，對黃瓜[22]、辣椒[23]、黑麥草[24]等多種作物的研究均發(fā)現(xiàn)，提高抗氧化酶活性，有利于減少活性氧的生成。SOD、POD是活性氧清除系統(tǒng)中重要的抗氧化酶。SOD主要作用是催化超氧陰離子自由基，使其發(fā)生歧化反應(yīng)，分解為過氧化氫和氧氣，POD主要是通過催化過氧化氫與底物發(fā)生反應(yīng)，起到清除過氧化氫的作用，從而減少對細(xì)胞的毒害作用[25-26]。但也有研究表明，POD的功能具有兩面性，它參與活性氧的產(chǎn)生，并能引發(fā)膜脂過氧化[27-28]。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量多少在一定程度上代表著膜脂質(zhì)過氧化水平，同時(shí)還與煙葉的衰老程度相關(guān)[27]。本研究結(jié)果表明，打頂后噴施Na2WO4煙株的SOD、POD的活性均表現(xiàn)為先升高后下降。除打頂后30 d，Na2WO4處理煙株的SOD和POD活性均顯著高于對照，以T2、T3處理較高，這有利于對打頂后煙株活性氧的清除。在打頂后30 d時(shí)兩種酶活性降低且各處理差異不顯著，可能是由于此時(shí)煙葉已經(jīng)接近成熟。MDA含量一直升高，鎢酸鈉處理煙株的MDA含量均低于對照，以處理T2較對照顯著降低。MDA含量后期增幅較小，這可能是與此時(shí)期抗氧化酶活性的升高有關(guān)。說明噴施Na2WO4可以提高抗氧化酶的活性，降低MDA含量，對緩解打頂后煙株的氧化脅迫具有重要作用。

煙株打頂可以誘導(dǎo)煙堿合成，主要是氧化脅迫后生成的茉莉酸刺激了煙堿合成酶的活性，導(dǎo)致煙葉的煙堿含量增多[29-30]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Na2WO4濃度越高降低煙堿能力越強(qiáng)，上部葉和中部葉均以T3處理最好，T2次之。煙堿含量的降低，除了與打頂后抗氧化酶活性有關(guān)[31-32]，可能也與鎢酸鈉減弱煙株的氮代謝和根系活力相關(guān)[33]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，對打頂后生長過旺的煙株噴施Na2WO4，能夠提高煙葉抗氧化酶的活性，減弱打頂后煙株的氮代謝、根系活力、MDA和煙堿含量。同時(shí)通過對各項(xiàng)指標(biāo)的綜合評價(jià)發(fā)現(xiàn)噴施1.0 mmol/L的鎢酸鈉的效果最佳，但是關(guān)于鎢酸鈉對影響煙株煙堿合成的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。