李增強(qiáng)，張 賢，王建紅*，曹 凱，徐昌旭，曹衛(wèi)東

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021； 2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所，江西 南昌 330200； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

土壤有機(jī)碳(SOC)是土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力的重要指標(biāo)，能夠顯著影響土壤物理性質(zhì)、養(yǎng)分供應(yīng)和微生物活性[1]。由于土壤總有機(jī)碳含量較高且土壤環(huán)境復(fù)雜多變，短期不同土壤管理措施對(duì)土壤總有機(jī)碳含量無明顯影響[2]。因此越來越多的研究采用土壤活性有機(jī)碳組分(如可溶性有機(jī)碳、熱水提取態(tài)有機(jī)碳、微生物生物量碳和顆粒有機(jī)碳)表征土壤管理措施和環(huán)境條件的變化[2-4]。土壤活性有機(jī)碳組分是指土壤中周轉(zhuǎn)時(shí)間較短，易被微生物利用的有機(jī)碳組分[2]。雖然這部分有機(jī)碳在土壤總有機(jī)碳中所占比重較小，但是與土壤大團(tuán)聚體的形成和穩(wěn)定有顯著相關(guān)關(guān)系，對(duì)土壤養(yǎng)分含量和轉(zhuǎn)化供應(yīng)有著重要影響[5-6]。此外，研究表明土壤活性有機(jī)碳組分與溫室氣體(如CO2、CH4等)排放存在顯著相關(guān)關(guān)系[7]。由于土壤活性有機(jī)碳對(duì)土壤管理措施的反應(yīng)比土壤總有機(jī)碳更靈敏，且與土壤其他性質(zhì)的變化密切相關(guān)，因此成為評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量及管理措施的一個(gè)重要指標(biāo)[2-3]。

土壤酶主要來自于土壤微生物以及活體動(dòng)植物，是推動(dòng)土壤中生物和生物化學(xué)過程的重要?jiǎng)恿?，可以作為?gòu)成土壤功能和生物活性的重要指標(biāo)[8]。其中部分土壤酶活性與土壤有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化存在密切關(guān)系。研究表明纖維素酶活性與可溶性有機(jī)碳含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系[9-10]，這可能是由于纖維素酶能夠?qū)㈦y溶的纖維素類物質(zhì)分解為纖維二糖、果糖和葡萄糖等易溶于水的小分子成分[11]。Sinsabaugh[12]認(rèn)為降低酚氧化酶活性有利于土壤中可溶性酚類物質(zhì)的累積，從而抑制水解酶類的活性，減少其對(duì)土壤有機(jī)碳的分解，進(jìn)而有利于土壤有機(jī)碳的固存。因此明確土壤碳轉(zhuǎn)化酶與活性有機(jī)碳組分的關(guān)系對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估碳組分的變化具有重要意義。

紫云英(AstragalussinicusL.)是我國(guó)南方水稻生產(chǎn)區(qū)重要的冬季綠肥，翻壓還田后能夠減少化肥使用、改良土壤結(jié)構(gòu)、促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)累積和養(yǎng)分供應(yīng)[13]。目前關(guān)于翻壓紫云英綠肥的研究主要集中在作物養(yǎng)分吸收、土壤理化性質(zhì)變化等方面[14-16]，而對(duì)于土壤碳轉(zhuǎn)化酶活性及其與土壤活性有機(jī)碳組分關(guān)系等方面的研究較少。本文通過田間定位試驗(yàn)，研究不同紫云英施用量下土壤活性有機(jī)碳組分以及土壤碳轉(zhuǎn)化酶活性的變化，探討與碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶活性與活性有機(jī)碳組分變化的關(guān)系，以期為揭示長(zhǎng)期紫云英綠肥還田對(duì)稻田土壤肥力及可持續(xù)生產(chǎn)能力的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況與供試材料

試驗(yàn)位于浙江省金華市婺城區(qū)蔣堂農(nóng)業(yè)科學(xué)試驗(yàn)站(119°32′12″ E，29°04′8″ N)。該地屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候，全年平均日照時(shí)數(shù)約1 700 h，平均降水量約1 500 mm，平均氣溫約17.9 ℃。試驗(yàn)地土壤類型為紅壤黃筋泥土發(fā)育而成的水稻土，試驗(yàn)前土壤基礎(chǔ)肥力為：有機(jī)質(zhì)含量21.5 g·kg-1，全氮1.45 g·kg-1，堿解氮248.2 mg·kg-1，有效磷(P)25.0 mg·kg-1，速效鉀(K)34.4 mg·kg-1，pH值5.38。試驗(yàn)選用的紫云英品種是當(dāng)?shù)刂髟缘摹皩幉ù髽蚍N”，鮮草含水量為92.1%，氮、磷、鉀含量分別為3.82、0.39、3.61 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2011年4月開始，共設(shè)6個(gè)處理：(1)對(duì)照(CK)，不施用任何肥料；(2)常規(guī)施用化肥(CF)；(3)翻壓紫云英鮮草30 t·hm-2(GM30)；(4)翻壓紫云英鮮草60 t·hm-2(GM60)；(5)翻壓紫云英鮮草90 t·hm-2(GM90)；(6)翻壓紫云英鮮草120 t·hm-2(GM120)。每個(gè)處理均設(shè)4個(gè)重復(fù)小區(qū)，小區(qū)面積為20 m2，隨機(jī)排列。每年4月中旬按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)翻壓盛花期的紫云英，然后各小區(qū)淹水常規(guī)管理。為了避免紫云英根系對(duì)土壤生物化學(xué)性質(zhì)的影響，本試驗(yàn)采用紫云英鮮草異地還田的方式進(jìn)行。

供試水稻品種為“甬優(yōu)9號(hào)”，5月上旬育秧，選用分蘗2～3個(gè)且長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的秧苗植株于6月中旬移栽至各小區(qū)。CF處理，于秧苗移栽的前一天施用碳酸氫銨525.0 kg·hm-2，過磷酸鈣375.0 kg·hm-2作為基肥，在分蘗初期施用尿素187.5 kg·hm-2、氯化鉀112.5 kg·hm-2，在孕穗期施用尿素75.0 kg·hm-2，氯化鉀75.0 kg·hm-2。翻壓紫云英的4個(gè)處理均不施用任何化肥。

1.3 樣品采集與測(cè)定

2016年水稻收獲后，采用多點(diǎn)混合采樣法采集不同處理的表層(0～20 cm)土壤樣品。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將樣品中的石礫、根系及動(dòng)植物殘?bào)w等挑出，一部分直接過2 mm篩，然后保存在4 ℃冰箱中；另一部分風(fēng)干后過2 mm篩，備用。

土壤可溶性有機(jī)碳(DOC)采用Jones等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定：稱取5 g新鮮土樣，加入25 mL蒸餾水，震蕩1 h，離心。上清液采用0.45 μm濾膜過濾，然后用TOC分析儀(Multi N/C 3100)測(cè)定其中有機(jī)碳含量。熱水提取態(tài)有機(jī)碳(HEOC)采用Ghani等[3]的方法進(jìn)行測(cè)定：稱取5 g新鮮土樣，加入50 mL蒸餾水，震蕩30 min，離心去除上清液。重新加入50 mL蒸餾水，渦旋使其充分混合，封口，放入80 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，保溫16 h。冷卻至室溫后離心，上清液利用0.45 μm濾膜過濾，利用TOC分析儀測(cè)定其中有機(jī)碳含量。土壤微生物生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法測(cè)定，以熏蒸土樣與不熏蒸土樣提取的有機(jī)碳的差值除以轉(zhuǎn)換系數(shù)Kc(0.45)計(jì)算土壤微生物生物量碳[18]。顆粒有機(jī)碳(POC)采用六偏磷酸鈉溶液提取，利用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定其中碳含量[4]。土壤總有機(jī)碳(TOC)含量也采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定[19]。

纖維素酶和蔗糖酶活性分別以羧甲基纖維素鈉和蔗糖為底物，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定；β-葡萄糖苷酶活性以對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷為底物，采用比色法測(cè)定[8]。酚氧化酶和過氧化物酶活性以L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine，左旋多巴)為底物，采用比色法測(cè)定[20]。上述酶活性均采用新鮮土樣測(cè)定。

總體酶活性采用下面的公式計(jì)算[21]：

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均以烘干土計(jì)(105 ℃，24 h)。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Tukey法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(α=0.05水平)；土壤活性有機(jī)碳組分含量與碳轉(zhuǎn)化酶活性之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析和逐步回歸分析，整個(gè)數(shù)據(jù)分析過程采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行。表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤活性有機(jī)碳和總有機(jī)碳

由表1可知，不同活性有機(jī)碳組分對(duì)不同處理的響應(yīng)不同。與CK處理相比，CF、GM30、GM60、GM90和GM120處理的土壤可溶性有機(jī)碳(DOC)含量分別增加了19.6%、27.7%、59.8%、75.3%和97.6%(P<0.05)，熱水提取態(tài)有機(jī)碳(HEOC)含量分別增加了17.9%、24.2%、36.3%、43.1%和55.9%(P<0.05)，微生物生物量碳(MBC)含量分別增加了16.4%、22.0%、32.6%、38.3%和48.5%(P<0.05)，顆粒有機(jī)碳(POC)含量分別增加了20.7%、31.0%、44.8%、55.2%和65.5%(P<0.05)，總有機(jī)碳(TOC)含量則分別增加了8.9%、14.6%、20.3%、21.1%和32.5%(P<0.05)。

表1 不同處理下土壤活性有機(jī)碳組分和總有機(jī)碳含量變化

注：同一列中不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

不同活性有機(jī)碳占總有機(jī)碳的比例依次為POC/TOC>MBC/TOC>HEOC/TOC>DOC/TOC(表2)。其中DOC/TOC和HEOC/TOC值表現(xiàn)為CK

表2 不同處理下土壤活性有機(jī)碳組分占總有機(jī)碳的比例 (%)

2.2 土壤酶活性

由表3可知，與CK處理相比，CF、GM30、GM60、GM90和GM120處理的纖維素酶活性分別增加了14.3%、24.8%、40.6%、42.9%和54.9%(P<0.05)，蔗糖酶活性分別增加了27.2%、44.9%、92.5%、91.7%和186.8%(P<0.05)，β-葡萄糖苷酶活性分別增加了41.9%、51.0%、91.9%、127.5%和165.0%(P<0.05)，酚氧化酶活性分別增加了7.1%、7.1%、14.3%、14.3%和21.4%(P<0.05)，過氧化物酶活性分別增加了16.7%、16.7%、21.7%、23.3%和28.3%(P<0.05)。與CK處理相比，CF和施用紫云英處理(GM30、GM60、GM90和GM120)均顯著增加了總體酶活性。

表4是酶活性與微生物生物量碳的比值，用來表征相對(duì)酶活性。相對(duì)纖維素酶活性在不同處理間無顯著差異。CK處理的相對(duì)蔗糖酶和相對(duì)β-葡萄糖苷酶活性與CF和GM30處理相比無顯著差異，但是顯著低于GM60、GM90和GM120處理。CK處理的相對(duì)酚氧化酶和相對(duì)過氧化物酶活性與CF處理相比無顯著差異，但是顯著高于GM60、GM90和GM120處理。

2.3 土壤活性有機(jī)碳和酶活性的關(guān)系

由表5可知，土壤不同活性有機(jī)碳之間、活性有機(jī)碳與總有機(jī)碳之間均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。不同酶活性之間也存在顯著正相關(guān)關(guān)系。另外，不同有機(jī)碳組分和酶活性以及總酶活性之間也存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

表3 不同處理下土壤酶活性和總體酶活性的變化

表4 不同處理下土壤酶活性與微生物生物量碳的比值

表5 土壤活性有機(jī)碳組分與酶活性間的相關(guān)性分析

注：**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。

采用逐步回歸分析進(jìn)一步分析土壤酶活性與活性有機(jī)碳含量的關(guān)系(表6)。不同酶對(duì)活性有機(jī)碳組分的影響程度不同，其中β-葡萄糖苷酶和纖維素酶是影響DOC的主要酶，纖維素酶、酚氧化酶和蔗糖酶顯著影響HEOC，MBC主要受β-葡萄糖苷酶和酚氧化酶的影響，POC主要受纖維素酶的影響。

表6 土壤活性有機(jī)碳組分與酶活性的逐步回歸分析

注：Y代表相應(yīng)的活性有機(jī)碳組分，X1代表纖維素酶活性，X2代表β-葡萄糖苷酶活性，X3代表酚氧化酶活性。

3 討論

土壤活性有機(jī)碳是土壤碳庫的重要組成部分，與土壤養(yǎng)分供應(yīng)、微生物活性等具有密切關(guān)系，能夠快速響應(yīng)田間管理措施的變化[2-3]。本研究表明，隨著紫云英施用量的增加，各處理的土壤活性有機(jī)碳組分含量分別較對(duì)照處理有顯著提高，這與李正等[22]的部分研究結(jié)果相似。研究表明土壤活性有機(jī)碳組分主要來自于外源有機(jī)物質(zhì)和土壤有機(jī)碳的分解過程[2]。隨著紫云英施用量的增加，有利于土壤微生物將更多的紫云英碳轉(zhuǎn)化為土壤活性有機(jī)碳組分。另外，隨著紫云英施用量的增加，水稻產(chǎn)量和秸稈生物量顯著增加[14]，從而導(dǎo)致更多的根系分泌物輸入土壤中。由于根系分泌物主要是由易溶于水的小分子有機(jī)物質(zhì)組成[23]，因此根系分泌物的輸入能夠直接促進(jìn)土壤活性有機(jī)碳組分含量的增加。

由于活性有機(jī)碳易于被土壤微生物利用，活性有機(jī)碳組分與總有機(jī)碳的比值可在一定程度上表征土壤有機(jī)碳分解、礦化的難易程度，其值越大，表明土壤有機(jī)碳活性越高，較易礦化，周轉(zhuǎn)期較短[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照處理相比，隨著紫云英施用量的增加，DOC/TOC、HEOC/TOC、MBC/TOC和POC/TOC值均顯著增加。一方面這可能是因?yàn)樽显朴⒈旧砗写罅康目扇苄杂袡C(jī)物，紫云英施入土壤后這些物質(zhì)能夠直接轉(zhuǎn)變?yōu)橥寥阑钚杂袡C(jī)碳組分，從而提高了活性有機(jī)碳組分的相對(duì)比例；另一方面紫云英作為一種新鮮有機(jī)物料施入土壤后能夠促進(jìn)原有土壤有機(jī)碳的分解(激發(fā)效應(yīng))[1]，形成更多的土壤活性有機(jī)碳，從而也能夠增加土壤活性有機(jī)碳的相對(duì)比例。徐一蘭等[25]利用長(zhǎng)期定位試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)隨著有機(jī)肥施用量的增加MBC/TOC值顯著增加。

土壤酶是土壤生物活性的重要指標(biāo)，能夠推動(dòng)土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動(dòng)，對(duì)土壤肥力的形成和變化具有重要影響[8]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著綠肥施用量的增加，酚氧化酶和過氧化物酶活性顯著增加。田小明等[26]利用盆栽試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)土壤酚氧化酶活性與生物有機(jī)肥施用量成正比。由于土壤酶活性不僅受環(huán)境條件(如溫度、水分含量等)的顯著影響，而且與底物濃度呈正相關(guān)關(guān)系[8]，紫云英施用量的增加能夠?yàn)橄鄳?yīng)的酶提供更多的酚類和木質(zhì)素類底物，從而導(dǎo)致兩種酶活性的顯著增加。另外本研究也發(fā)現(xiàn)纖維素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性隨著紫云英施用量的增加而顯著增加，這與葉協(xié)鋒等[27]的研究結(jié)果類似。路文濤等[28]也發(fā)現(xiàn)隨著外源有機(jī)物質(zhì)(秸稈)施用量的增加，土壤蔗糖酶活性顯著增加。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒗w維素類物質(zhì)催化分解為易溶于水的糖類物質(zhì)[11]，蔗糖酶主要參與二糖類物質(zhì)的催化分解[8]。纖維素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性的增加一方面可能是由底物濃度的增加所引起的，另一方面，增加土壤酚氧化酶活性能夠?qū)⒏嗟姆宇愇镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為醌類，從而能夠消除土壤酚類物質(zhì)對(duì)這3種水解酶類的毒害作用，提高纖維素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性[29]。

由于大部分酶都是土壤微生物合成和釋放的，用絕對(duì)酶活性與MBC的比值表征相對(duì)酶活性能夠消除微生物對(duì)酶活性的影響，從而更加準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)不同管理措施對(duì)酶活性的影響[30]。Lagomarsino等[31]認(rèn)為酶活性與MBC的比值越高表明酶催化活性越強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，隨著紫云英施用量的增加，相對(duì)蔗糖酶和相對(duì)β-葡萄糖苷酶活性均顯著增加。一方面可能是因?yàn)橥庠创罅坑袡C(jī)物質(zhì)的輸入能夠直接提高酶的催化活性，另一方面可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期施用綠肥能夠?yàn)槊柑峁└嗟母街稽c(diǎn)并且改善了酶促反應(yīng)的微域環(huán)境條件，從而提高了酶的催化活性[32]。然而，研究也發(fā)現(xiàn)與對(duì)照處理相比，隨著紫云英施用量的增加，相對(duì)酚氧化酶和相對(duì)過氧化物酶活性顯著降低。酚氧化酶和過氧化物酶均屬于氧化酶類，主要參與土壤中木質(zhì)素等復(fù)雜物質(zhì)的氧化降解過程，進(jìn)而為微生物群落提供足夠的碳源和養(yǎng)分等物質(zhì)[33]。由于紫云英中含有豐富的易利用碳源和養(yǎng)分，隨著紫云英施用量的增加，土壤微生物群落對(duì)于來自土壤的碳源和養(yǎng)分的依賴性逐漸降低，從而導(dǎo)致相對(duì)酚氧化酶和相對(duì)過氧化物酶活性的降低。

土壤酶參與一系列的土壤生化過程，與土壤有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。本研究表明，土壤活性有機(jī)碳組分與土壤酶活性間均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這與Li等[34]的研究結(jié)果相似。通過逐步回歸分析則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和酚氧化酶是影響活性有機(jī)碳的關(guān)鍵酶。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶均為水解酶，能夠?qū)⑼庠摧斎氲挠袡C(jī)物質(zhì)或土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為活性有機(jī)碳。Wickings等[11]認(rèn)為纖維素酶和β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒗w維素轉(zhuǎn)化為活性有機(jī)碳。而酚氧化酶通過氧化酚類物質(zhì)，減少其在土壤溶液中的累積，從而降低酚類物質(zhì)對(duì)水解酶的毒害作用，進(jìn)而提高水解酶類活性，促進(jìn)活性有機(jī)碳的形成[12]。

4 結(jié)論

增加紫云英施用量能夠顯著增加土壤活性有機(jī)碳組分含量以及土壤活性有機(jī)碳組分與總有機(jī)碳的比值，提高與碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶活性。不同碳轉(zhuǎn)化酶的相對(duì)活性對(duì)紫云英施用量的響應(yīng)不同，其中相對(duì)蔗糖酶和相對(duì)β-葡萄糖苷酶活性隨著紫云英施用量的增加而顯著增加，而相對(duì)酚氧化酶和相對(duì)過氧化物酶活性則隨著紫云英施用量的增加而顯著降低。增加纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活性能夠提高DOC含量，增加纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和酚氧化酶活性能夠提高HEOC含量，增加β-葡萄糖苷酶和酚氧化酶活性能夠提高M(jìn)BC含量，增加纖維素酶活性能夠提高POC含量。