廖常青，陳 英，向 聰，雷東陽(yáng)*

（1湖南豐神農(nóng)業(yè)科技有限公司，長(zhǎng)沙 410000；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

稻瘟病是水稻生產(chǎn)中破壞程度最大的病害，目前已經(jīng)成為影響水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要因素之一［1］。用農(nóng)藥防治稻瘟病會(huì)造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留。目前，培育帶有稻瘟病廣譜抗性基因的水稻是防治稻瘟病最環(huán)保并且經(jīng)濟(jì)有效的方法［2］。但是稻瘟病的變異較快，抗稻瘟病品種在推廣3～5年后，毒性菌株漸漸成為優(yōu)勢(shì)小種，最終使品種抗性喪失。主要是因?yàn)榭共∑贩N所攜帶的抗病基因抗譜較窄，病害遇到易發(fā)病的環(huán)境時(shí)就會(huì)迅速蔓延［3］。因此，培育出性狀優(yōu)良的抗稻瘟病品種是育種專(zhuān)家追求的目標(biāo)。

兩系不育系創(chuàng)5S不育性較穩(wěn)定，可恢復(fù)性較好，不育起點(diǎn)溫度低，株型理想，配合力較強(qiáng)并且異交結(jié)實(shí)好［4］。由于稻瘟病生理小種近年來(lái)不斷產(chǎn)生變異，導(dǎo)致創(chuàng)5S對(duì)稻瘟病的抗性逐步衰退?？剐曰虻某晒?dǎo)入可以顯著提高品種抗性和抗譜，而MAS是實(shí)現(xiàn)抗性基因?qū)牒秃Y選的有效方法［5］。Pigm是一個(gè)廣譜稻瘟病抗性基因，來(lái)源于持久抗稻瘟病品種谷梅4號(hào)，目前該基因已經(jīng)被克隆，其抗性比公認(rèn)的 Pi1，Pi2，Pi3／Pi5廣譜抗性更加廣泛［6］。江南［7］通過(guò)對(duì) Pi40（t）進(jìn)行抗譜分析，精細(xì)定位，最終將該基因精細(xì)定位于標(biāo)記T3和CG5E－Pi2之間。本研究擬通過(guò)雜交、回交和分子標(biāo)記輔助選擇將IR65482中的廣譜抗稻瘟病基因Pi40和谷梅4號(hào)中的廣譜抗稻瘟病基因Pigm導(dǎo)入到水稻兩系不育系創(chuàng)5S中，定向改良水稻兩系不育系創(chuàng)5S，旨在培育出綜合性狀優(yōu)良、具有持久抗性的水稻改良不育系，為抗病雜交水稻新品種的培育提供優(yōu)良的抗性親本。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 技術(shù)路線

以?xún)上挡挥祫?chuàng)5S為受體，通過(guò)與谷梅4號(hào)和IR65482兩個(gè)供體親本雜交，并以創(chuàng)5S作為輪回親本連續(xù)回交直到BC3F1代。每次回交均篩選目標(biāo)單株與輪回親本回交，篩選到的目標(biāo)單株須含供體抗性基因，且農(nóng)藝性狀與輪回親本相似。BC3F2世代利用分子標(biāo)記技術(shù)篩選攜帶純合目的基因的單株，各個(gè)世代在利用分子技術(shù)選擇目的基因的同時(shí)，篩選植株農(nóng)藝性狀接近輪回親本的優(yōu)良株系，最后對(duì)BC3F2株系進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定并與親本進(jìn)行農(nóng)藝性狀的比較（圖1）。

圖1 抗性改良技術(shù)路線圖Fig.1 Technical roadmap for improved resistance to rice blast

1.2.2 基因型鑒定

據(jù)已有的研究基礎(chǔ)［8，9］，挑選與目標(biāo)基因 Pi40和Pigm緊密連鎖的標(biāo)記 Indel3、RM527、RM3330、ZJ58、RM7311對(duì)目標(biāo)基因在受體親本和供體親本之間進(jìn)行多態(tài)性篩選，目的是篩選到在親本之間多態(tài)性較好的引物。

PCR總反應(yīng)體系含0.2μmol／L正、反向引物各0.2μL、5μL 2×EasyTaqSuperMix、1μLDNA模板及3.6μLddH2O。引物RM527和 RM7311的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)條件為 94℃變性 30 s，58℃復(fù)性 30 s，72℃延伸1 min，最后在72℃中延伸5 min，4℃下保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%濃度下的瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離結(jié)束后放置于凝膠成像系統(tǒng)中，拍照并記錄。

1.2.3 稻瘟病鑒定

改良株系的稻瘟病抗性鑒定在湖南省瀏陽(yáng)市大圍山抗性鑒定圃進(jìn)行。此地區(qū)屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，7月平均氣溫28.9℃，海拔約400 m，空氣濕度大，是稻瘟病高發(fā)區(qū)域。供試材料2017年5月8日播種，6月10日移栽，每份材料按照6行×8株單本插，株行距20 cm×25 cm，順序排列，無(wú)重復(fù)，四周栽插對(duì)照感病品種CO39，9月下旬日進(jìn)行稻瘟病抗性調(diào)查。葉瘟病級(jí)、穗瘟發(fā)病率、穗瘟損失率和穗瘟病級(jí)均按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記錄。分蘗盛期調(diào)查葉瘟，求出加權(quán)平均值即為發(fā)病等級(jí)，收種前調(diào)查穗瘟發(fā)病率和損失率，調(diào)查穗數(shù)不少于80穗。稻瘟病抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)和方法采用綜合指數(shù)法，即葉瘟病級(jí)、穗瘟發(fā)病率和損失率病級(jí)的加權(quán)指數(shù)（表1）。

表1 稻瘟病抗性評(píng)價(jià)綜合指數(shù)Table 1 Composite index for blast resistance evaluation

1.2.4 農(nóng)藝性狀考察

零售企業(yè)配送中心建設(shè)首先要考慮配送中心的選址，考慮政策、地租、氣候、與企業(yè)上下游的距離、交通、門(mén)店分布等各方面情況，綜合考量采取重心法選擇合適配送中心地理位置；接著投入大量的資金購(gòu)買(mǎi)必要的物流設(shè)施和設(shè)備，必須建成完善的網(wǎng)絡(luò)信息系系統(tǒng)；配送中心的建設(shè)需要軟件硬件的配合，除了硬件設(shè)施、設(shè)備外，還需要員工具有現(xiàn)代化的物流職業(yè)素養(yǎng)，只有軟硬件的默契配合才能夠?qū)崿F(xiàn)配送中心的合理運(yùn)營(yíng)。

將改良株系與輪回親本創(chuàng)5S種植在相同條件的試驗(yàn)田中，隨機(jī)選取創(chuàng)5S、各改良株系各15株（不取邊行）。主要考察株高、單株穗數(shù)、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬、劍葉角度、穗長(zhǎng)、每穗總穎花數(shù)、柱頭外露率等性狀。將親本創(chuàng)5S作為對(duì)照，比較改良株系與親本創(chuàng)5S的性狀差異是否顯著。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

圖2A中引物多態(tài)性篩選結(jié)果顯示，RM7311在受體親本創(chuàng)5S中擴(kuò)增出的產(chǎn)物較大，而在供體親本谷梅4號(hào)中擴(kuò)增出的產(chǎn)物較小，受體和供體之間的PCR產(chǎn)物帶型具有明顯的多態(tài)性。表明RM7311在谷梅4號(hào)和創(chuàng)5S間具有較好的多態(tài)性，該標(biāo)記能夠有效地應(yīng)用于各回交世代的分子標(biāo)記輔助選擇。

圖2B中引物多態(tài)性篩選結(jié)果顯示，RM527在受體親本創(chuàng)5S中擴(kuò)增出的產(chǎn)物較小，而在供體親本IR65482中擴(kuò)增出的產(chǎn)物較大，受體和供體之間的PCR產(chǎn)物電泳帶型間差異明顯。表明RM527在IR65482和創(chuàng)5S間具有較好的多態(tài)性，該標(biāo)記能夠有效地應(yīng)用于各回交世代的分子標(biāo)記輔助選擇，并能篩選到含有目的基因的抗性單株。

Pigm、Pi40基因的連鎖多態(tài)性分子標(biāo)記及引物序列如表2所示。

表2 水稻稻瘟病抗性基因的連鎖標(biāo)記及引物序列Table 2 Linked markers of blast resistance gene and it’s primer sequences

圖2 稻瘟病抗性基因引物篩選結(jié)果Fig.2 Primer screening result of rice blast resistance gene

2.2 分離世代株系基因型檢測(cè)

利用多態(tài)性分子標(biāo)記RM7311和RM527對(duì)不同回交世代群體進(jìn)行基因型選擇，在3個(gè)回交世代中，雜合帶型與受體親本純合帶型的基因型分離比例基本表現(xiàn)為1∶1。在改良過(guò)程中，需要有足夠規(guī)模的基礎(chǔ)群體，以確保能夠篩選到綜合性狀優(yōu)良且含有目的基因的不育系單株。

在回交世代群體BC3F1中，選擇了6個(gè)農(nóng)藝性狀與受體親本創(chuàng)5S相似的優(yōu)良單株，其中含抗性目的基因Pigm的改良不育系3個(gè)（17S10、17S11和17S13），含抗性目的基因 Pi40的改良系 3個(gè)（17S16、17S18、17S19），自交獲得 BC3F2代不育系種子，繼續(xù)利用分子標(biāo)記RM7311和RM527分別進(jìn)行檢測(cè)，部分植株的基因型結(jié)果如圖3。

圖3 利用Pi40和Pigm改良創(chuàng)5S稻瘟病抗性BC3 F2世代的分子檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Molecular test result of Improved Chuang 5S carrying Pi40 and Pigm in BC3 F2 Generation.

2.3 改良株系稻瘟病抗性鑒定

2017年夏季將創(chuàng)5S改良后代BC3F2代株系種植于大圍山稻瘟病病圃進(jìn)行田間抗性鑒定。結(jié)果表明，受體親本創(chuàng)5S的葉瘟為5級(jí)，供體親本谷梅4號(hào)為2級(jí)，IR65482為3級(jí)（表3）。利用谷梅4號(hào)改良創(chuàng)5S的3個(gè)不育系株系，17S10葉瘟為4級(jí)，17S11和17S13葉瘟為3級(jí)；其穗瘟病級(jí)3～5級(jí)，表現(xiàn)中等抗病至中感病，而創(chuàng)5S的穗瘟發(fā)病率為45.5%，表現(xiàn)感病，改良株系的穗瘟病發(fā)病率平均較創(chuàng)5S降低了74.8%，3個(gè)改良株系的穗瘟損失率平均較創(chuàng)5S降低了82.0%。3個(gè)改良株系的綜合抗性指數(shù)2～2.8，所改良的3個(gè)株系的綜合抗性指數(shù)均略低于谷梅4號(hào)，但較受體親本創(chuàng)5S顯著提高（平均提高了58.7%）。利用IR56482改良的3個(gè)不育系株系中，17S16、17S19葉瘟均為4級(jí)，17S18葉瘟表現(xiàn)為3級(jí)；其穗瘟發(fā)病率為8.0%～20.4%，穗瘟病級(jí)3～5級(jí)，表現(xiàn)中抗病至中感病，3個(gè)改良株系的穗瘟病發(fā)病率平均較創(chuàng)5S降低了73.0%；綜合抗性指數(shù)為2.0～2.8，綜合抗性稍弱于谷梅4號(hào)，但較受體親本創(chuàng) 5S顯著提高（平均提高54.0%）。

從表3可知，谷梅4號(hào)的綜合抗性略強(qiáng)于IR65482，將谷梅4號(hào)中的抗性基因Pigm導(dǎo)入創(chuàng)5S后獲得的改良系，其綜合抗性基本上強(qiáng)于將抗性基因Pi40導(dǎo)入創(chuàng)5S后所獲得的改良系。田間抗性鑒定結(jié)果表明，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)創(chuàng)5S的稻瘟病抗性改良是成功的。

表3 創(chuàng)5S改良后代BC3 F2株系的稻瘟病鑒定結(jié)果Table 3 Identification of rice blast resistance line of improved Chuang 5S

2.4 改良株系農(nóng)藝性狀考察

由表4可知，各改良株系基本保持了受體親本的優(yōu)良性狀，部分性狀甚至優(yōu)于受體親本創(chuàng)5S。利用谷梅4號(hào)改良創(chuàng)5S的3個(gè)不育系株系中，17S10農(nóng)藝性狀略?xún)?yōu)于對(duì)照創(chuàng)5S；17S11的單株穗數(shù)、劍葉角度和每穗總穎花數(shù)顯著優(yōu)于對(duì)照；17S13的穗數(shù)和每穗總穎花數(shù)等顯著優(yōu)于對(duì)照，但劍葉略長(zhǎng)于對(duì)照。

利用IR65482改良的3個(gè)不育系株系中，17S16劍葉角度顯著優(yōu)于對(duì)照創(chuàng)5S；17S18劍葉角度顯著優(yōu)于對(duì)照，但劍葉略長(zhǎng)于對(duì)照。

以上結(jié)果表明，在各株系中，含Pi40基因的改良系17S18不僅在抗稻瘟病性方面顯著高于創(chuàng)5S，而且其他農(nóng)藝性狀與創(chuàng)5S相當(dāng)。含Pigm基因的改良系17S11不僅抗稻瘟病性顯著高于創(chuàng)5S，而且其他農(nóng)藝性狀已接近或優(yōu)于創(chuàng)5S。

表4 改良不育系與親本農(nóng)藝性狀比較Table 4 Com parison of agronom ical traits of im proved sterile lines w ith parents

3 討論

由于稻瘟病對(duì)水稻的危害性極大，培育性狀優(yōu)良且抗稻瘟病的水稻品種成了育種家們追求的目標(biāo)。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)等方法很大程度上促進(jìn)了水稻遺傳育種工作［10，11］。本研究利用分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合田間表型鑒定和農(nóng)藝性狀選擇，將抗病效果好的目的基因?qū)氲缴a(chǎn)上應(yīng)用廣泛但抗病性相對(duì)欠佳的兩系不育系創(chuàng)5S中，在BC3F2世代篩選到了農(nóng)藝性狀與受體親本創(chuàng)5S基本相似且含抗性目的基因的單株，這些改良不育系抗性較創(chuàng)5S有了顯著提高，說(shuō)明利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良水稻稻瘟病抗性是有效可行的，并證明了含有Pigm或Pi40基因的改良系稻瘟病抗性好，其中含Pigm改良系的抗性效果更佳。

但是在研究中發(fā)現(xiàn)，同一世代含相同抗性基因的不同改良系的田間抗性表型略有差異，如不育系改良系17S18含有Pi40基因，表現(xiàn)為抗稻瘟病，而改良系17S16和17S19表現(xiàn)為中抗稻瘟病。這種現(xiàn)象可能是由于谷梅4號(hào)對(duì)稻瘟病的抗性并不是只有Pigm起作用，很可能在Pigm附近還存在一些未被發(fā)現(xiàn)的與其緊密連鎖的稻瘟病抗性基因，而在導(dǎo)入Pigm的過(guò)程中由于染色體遺傳交換，那些未被發(fā)現(xiàn)的但發(fā)揮作用的抗性基因片段因此而丟失，造成遺傳背景相同、抗性基因也相同的材料之間的抗性發(fā)生差異。

本研究結(jié)果表明，兩系不育系創(chuàng)5S導(dǎo)入稻瘟病抗性基因Pigm和Pi40后得到的改良系稻瘟病抗性都有了顯著提高。利用分子標(biāo)記選擇技術(shù)，初步創(chuàng)制出幾個(gè)導(dǎo)入單個(gè)稻瘟病基因的改良系，為培育抗稻瘟病雜交稻新品種提供了抗性親本材料，也為進(jìn)一步培育持久、廣譜的抗稻瘟病水稻新品種提供了優(yōu)良的中間材料。