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        一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

        2018-08-22 19:31:06王佳楠
        科學(xué)與財(cái)富 2018年21期

        王佳楠

        摘要:采集室內(nèi)觀賞植物巴西木葉片,經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、血平板篩選、發(fā)酵液排油能力測(cè)定和發(fā)酵液表面張力測(cè)定等,篩選出具有產(chǎn)生物表面活性劑能力的菌株J3-21。對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行,確定氯化銨和蔗糖為氮源和碳源時(shí),在28℃條件下,再補(bǔ)充部分酵母粉,可以使發(fā)酵液表面張力可降低至25 mN/m。

        關(guān)鍵詞:生物表面活性劑;表面張力;培養(yǎng)條件優(yōu)化

        生物表面活性劑(biosurfactant)是由微生物產(chǎn)生的具有高表面活性的生物分子,是集親水基和疏水基結(jié)構(gòu)于一身的兩親化合物[1,2]。相對(duì)于化學(xué)合成的表面活性劑,生物表面活性劑對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的毒性較低,且可生物降解。因此,生物表面活性劑的特性決定了其在醫(yī)藥、石油工業(yè)、化妝品、洗滌劑、環(huán)境工程和食品工業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[2]。植物葉片表面因?yàn)榇嬖谙炠|(zhì)等植物保護(hù)性物質(zhì),是篩選產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的微生物的重要環(huán)境之一。

        1.材料與方法

        1.1植物樣品

        室內(nèi)景觀植物巴西木葉片。

        1.2儀器與試劑

        LDZX-40BI型立式電熱壓力蒸汽滅菌器、ZD-85恒溫振蕩器、FA1104電子天平、SW-CJ2FD潔凈工作臺(tái)、LRH-280生化培養(yǎng)箱、JK99C全自動(dòng)表面張力儀。試劑均為分析純。

        1.3方法

        1)菌株富集與分離。稱(chēng)取樣品10g,加入90ml無(wú)菌水,150r/min搖床振蕩1h,取上清液10ml接種到100ml已滅菌的富集培養(yǎng)集中,于37℃、150r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)3d。在同樣條件下進(jìn)行二次培養(yǎng)。取二次富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液1mL,用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度)。巴西木葉片,置于富集培養(yǎng)基中,經(jīng)過(guò)15天富集后,將富集液體涂布于血平板培養(yǎng)基上,挑去能夠產(chǎn)生溶血圈的菌株,作為備選菌株。

        2)菌株的篩選。將純菌株接種到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72h。取100μl發(fā)酵液接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37℃、150r/min培養(yǎng)3d。取直徑20cm培養(yǎng)皿,經(jīng)過(guò)二次酸洗后加二次蒸餾水30ml,滴加8ml液體石蠟,等待20-30min,形成穩(wěn)定油膜后加入100μl發(fā)酵液于油膜中心,測(cè)定排油圈直徑。

        3)發(fā)酵培養(yǎng)。將純菌株接種到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28℃、150r/min條件下培養(yǎng)72h。

        4)單因素培養(yǎng)條件優(yōu)化。以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),對(duì)碳源、氮源的種類(lèi)及培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn),確定C源、N源的種類(lèi)及培養(yǎng)溫度。

        5)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以碳源、氮源、酵母粉和培養(yǎng)時(shí)間為影響因素,以各因素添加量和時(shí)間為不同水平,以表面張力下降情況和菌濃作為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn),如下表1:

        6)菌種鑒定 對(duì)篩選所得的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色及生理生化試驗(yàn)鑒定,確定細(xì)菌的種屬。

        2.結(jié)果與討論

        2.1產(chǎn)表面活性劑菌株的分離篩選結(jié)果

        對(duì)巴西木葉片中的微生物種群中表面活性物質(zhì)產(chǎn)生菌株進(jìn)行富集培養(yǎng),再經(jīng)過(guò)血平板分離,共獲得21株備選細(xì)菌菌株,對(duì)各菌株進(jìn)一步考察,測(cè)定發(fā)酵液的排油能力,得到備選產(chǎn)表面活性劑的菌株4株,測(cè)量到這些菌株的排油圈直徑,大于4cm,說(shuō)明這些菌株的代謝產(chǎn)物有較好的排油性能,而效果最好的一株菌編號(hào)為J3-21,排油圈直徑達(dá)6.5cm。

        2.2菌株培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

        1)碳源的選擇。分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉、草酸、可溶性淀粉為碳源,在28℃,初始pH值為7.0~7.2,150r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72h,分別測(cè)定發(fā)酵液的排油能力。

        由圖1a可知,蔗糖為碳源時(shí)菌株J3-21發(fā)酵液的排油活性最好,表面張力降低至27.2mN/m(注:20攝氏度條件下,空白培養(yǎng)基的表面張力為65.7mN/m),因此,選擇蔗糖為最佳碳源。

        2)氮源的選擇。分別以硝酸鈉、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、牛肉膏這 5種氮源,以蔗糖為碳源,初始pH值為7.0~7.2,28℃、150r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3d后,測(cè)定發(fā)酵液的排油活性。

        由圖1b可知,氯化銨為碳源時(shí)菌株J3-21發(fā)酵液的表面張力降低至25.2mN/m(注:20攝氏度條件下,空白培養(yǎng)基的表面張力為65.7mN/m),因此,選擇氯化銨為最佳氮源。

        3)培養(yǎng)溫度的選擇。以蔗糖為碳源,氯化銨為氮源,初始pH值為 7.0~7.2,分別于24、28、32、36℃,150r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3天,測(cè)定發(fā)酵液的排油活性。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時(shí),

        由圖1c可知,培養(yǎng)溫度為28℃時(shí)菌株J3-21發(fā)酵液的表面張力降低至25.2mN/m(注:20攝氏度條件下,空白培養(yǎng)基的表面張力為65.7 mN/m),因此,選擇28℃為較優(yōu)良的培養(yǎng)溫度。

        2.3 菌種鑒定

        對(duì)菌株J3-21進(jìn)行了革蘭氏染色、芽孢染色。在油鏡下觀察,該菌株呈細(xì)長(zhǎng)桿狀;革蘭氏染色后,菌體為紫色;經(jīng)孔雀綠-番紅染色后,可觀察到紅色的菌體和綠色的芽孢區(qū),芽孢較小。J3-21的生理生化反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2:

        3.結(jié)論

        綜合以上結(jié)果,培養(yǎng)基中,氮源和酵母粉添加量會(huì)對(duì)J3-21發(fā)酵液中菌濃和表面活性物質(zhì)產(chǎn)生較大影響,生物表面活性物質(zhì)產(chǎn)量與菌濃存在一定的負(fù)相關(guān),可能表活物質(zhì)對(duì)菌株具有一定的抑制作用,次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累不利于菌體的生長(zhǎng)。因此,后期實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)備通過(guò)培養(yǎng)中進(jìn)行補(bǔ)料的形式,在較高菌濃情況下對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料以產(chǎn)生更多的表面活性物質(zhì)。

        參考文獻(xiàn):

        [1]張卉,郝國(guó)良,徐俊斌.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,04:477-485

        [2]盧國(guó)滿.產(chǎn)表面活性劑菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及定量研究[D].湖南大學(xué),環(huán)境科學(xué)專(zhuān)業(yè),2006年

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