張 良 周進(jìn)學(xué) 肖 騰 向宏市

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是起源于二級(jí)膽管及其分支上皮的惡性腫瘤[1]。ICC腫瘤無(wú)包膜、邊緣不清，生物學(xué)行為特殊，可沿膽管壁周?chē)蛘呖v行浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，侵襲及轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)[2]。近年來(lái)，我國(guó)ICC發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害了我國(guó)居民的身體健康及生命安全[3]。根治手術(shù)是目前治療ICC的一線治療方案，但大多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，不適合進(jìn)行手術(shù)治療[4]。本研究旨在探討ICC中野生型p53誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1(Wild type p53 induced protein phosphatases，Wip1)[5]、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)表達(dá)水平及臨床意義，試圖為臨床治療ICC提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年7月至2016年7月鄭州頤和醫(yī)院及河南省腫瘤醫(yī)院收治的38例ICC患者肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本為研究對(duì)象。所有患者臨床資料齊全，且術(shù)前均未接受任何放化療及激素治療，未合并其他惡性腫瘤，其中男性21例，女性17例；患者年齡28～77歲，平均年齡(54.28±6.43)歲；高分化7例，中分化18例，低分化13例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例；肝炎病毒攜帶者10例(乙肝9例，丙肝1例)；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期24例。

同期選取36例與我院行手術(shù)切除術(shù)的膽管結(jié)石及膽道損傷者正常膽管組織標(biāo)本為對(duì)照，其中膽管結(jié)石27例，膽道損傷者9例，患者年齡25～69歲，平均年齡(55.26±5.54)歲。2組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行，且患者及家屬了解本研究，并同意簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)(Streptavidin-perosidase，S-P)試劑盒、DAB顯色試劑盒，購(gòu)自于北京中杉金橋技術(shù)公司；鼠抗人Wip1單克隆抗體，鼠抗人MMP-2單克隆抗體，購(gòu)自于武漢博士德生物有限公司。

1.3 方法

膽管組織標(biāo)本離體后立即放入液氮罐中速凍，于-80 ℃冰箱妥善保存?zhèn)溆?。所取?biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟切片；采用S-P方法，DAB顯色，利用S-P試劑盒檢測(cè)石蠟切片中Wip1、MMP-2蛋白表達(dá)，以已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS液代替一抗為陰性對(duì)照，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

Wip1、MMP-2均為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜表達(dá)，以胞質(zhì)/胞膜染色呈現(xiàn)棕黃色者為陽(yáng)性表達(dá)。400×高倍鏡下觀察，染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例：0為0分、0～25%為1分、>25%～75%為2分、>75%為3分。以細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分乘積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.1進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組之間Wip1、MMP-2蛋白表達(dá)水平比較

ICC組織中Wip1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為78.95%(30/38)，明顯高于正常膽管組織中Wip1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率8.33%(3/36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.308，P<0.05)，ICC組織中MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為73.68%(28/38)，明顯高于正常膽管組織中MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率5.56%(2/36)(χ2=35.596，P<0.05)。

2.2 Wip1、MMP-2蛋白表達(dá)與ICC臨床病理特征之間的關(guān)系

Wip1蛋白表達(dá)與ICC患者年齡、性別、臨床分期、有無(wú)肝炎、組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，與患者門(mén)靜脈浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)；MMP-2蛋白與ICC患者年齡、性別、有無(wú)肝炎、組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，與患者臨床分期、門(mén)靜脈浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Wip1、MMP-2蛋白表達(dá)與ICC臨床病理特征之間的關(guān)系/例

2.3 ICC組織中Wip1、MMP-2蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

采用卡方檢驗(yàn)與Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析，Wip1與MMP-2在ICC組織中表達(dá)呈較強(qiáng)正相關(guān)(γs=0.683，P<0.05)。

3 討論

ICC是臨床上發(fā)病率僅次于肝癌的一種肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)[6]。ICC解剖定位于肝內(nèi)，早期即可出現(xiàn)周邊衛(wèi)星灶或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，侵襲及轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)。肝葉切除是目前唯一可能治愈ICC的方法[7]，但因ICC病情進(jìn)展較快，臨床常無(wú)法有效把握ICC患者手術(shù)時(shí)機(jī)，預(yù)后效果較肝癌更差。探究ICC發(fā)病機(jī)制，尋找新的特異性腫瘤標(biāo)記物，或許可為ICC早期診斷及治療提供新思路。

Wip1基因是由PPM1D基因編碼，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP2C家族中成員之一[8]，位于人類(lèi)染色體17q23或q24區(qū)域。國(guó)外學(xué)者在野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Wip1基因與原癌基因Myc、Ras及Neul等具有明顯協(xié)同作用，Wip1基因被證實(shí)是一種新型的原癌基因[9]。隨后大量研究證實(shí)[10]，Wip1基因在卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中明顯高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后存在密切關(guān)系?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Wip1基因可直接或者間接作用于包括p53、ATM、p38MAPK、chk1、chk2、UNG2、MDm2在內(nèi)至少7種靶蛋白去磷酸化，從而降低p53轉(zhuǎn)錄活性來(lái)發(fā)揮致癌作用。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)Wip1基因在惡性腫瘤中表達(dá)研究相對(duì)較少。MMPs是機(jī)體一種重要的蛋白水解酶[11]，廣泛參與機(jī)體胚胎形成、創(chuàng)傷愈合、血管反應(yīng)等生理反應(yīng)，以及關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、病毒感染、癌癥轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程。研究表明[12]，MMPs不僅具有有效的清除細(xì)胞外基質(zhì)的作用，還能夠通過(guò)參與血管生長(zhǎng)因子的形成，起到促進(jìn)腫瘤血管新生，協(xié)助腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，廣泛參與機(jī)體內(nèi)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。MMP-2是MMPs家族重要成員之一，其能夠有效分解基膜主要成分，MMP-2在惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。研究表明[13-15]，MMP-2在胃癌、乳腺癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中呈明顯高表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展。因此，本研究以Wip1、MMP-2為研究靶點(diǎn)，探討二者在ICC組織中表達(dá)水平及其與ICC臨床病理特征之間的關(guān)系，試圖為早期診斷及治療ICC提供新的靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，ICC組織中Wip1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為78.95%，明顯高于正常膽管組織中Wip1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率8.33%；ICC組織中MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為73.68%，明顯高于正常膽管組織中MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率5.56%；可見(jiàn)正常組織中Wip1、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)均較低，Wip1、MMP-2在ICC組織中明顯上調(diào)表達(dá)，提示W(wǎng)ip1、MMP-2上調(diào)表達(dá)參與ICC疾病發(fā)生。進(jìn)一步探究二者與ICC臨床病理特征之間的關(guān)系可見(jiàn)，Wip1、MMP-2蛋白表達(dá)與ICC患者年齡、性別、有無(wú)肝炎、組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性，與患者門(mén)靜脈浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有門(mén)靜脈浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Wip1、MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)門(mén)靜脈浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其中MMP-2蛋白表達(dá)還與患者臨床分期關(guān)系密切，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者M(jìn)MP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期者，提示二者與ICC疾病發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，二者高表達(dá)與ICC侵襲及轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，推測(cè)Wip1、MMP-2可作為臨床早期診斷及治療ICC的潛在生物學(xué)靶點(diǎn)，對(duì)于臨床診治ICC具有一定指導(dǎo)意義。相關(guān)性分析結(jié)果可見(jiàn)，Wip1與MMP-2在ICC組織中表達(dá)呈較強(qiáng)正相關(guān)，說(shuō)明Wip1與MMP-2在ICC中異常表達(dá)具有協(xié)同作用，二者協(xié)同促進(jìn)ICC腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，其具體作用機(jī)制，值得進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Wip1、MMP-2在ICC中明顯高表達(dá)，二者參與肝內(nèi)膽管癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，二者與ICC門(mén)靜脈浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文首次提出Wip1與MMP-2在ICC中異常表達(dá)存在協(xié)同作用，后續(xù)將對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。