孫文棟 佟建洲 張向前 石鳳云 李連進(jìn) 范經(jīng)世

人腦膠質(zhì)瘤是顱腦外科常見的惡性腫瘤之一，多種基因的調(diào)控其的發(fā)生發(fā)展[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體突變體Ⅲ(EGFRvⅢ)是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)最常見的突變類型，在很多腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。本研究探討了人腦膠質(zhì)瘤組織中EGFRvⅢ的表達(dá)情況及其對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月至2016年9月本院收治的人腦膠質(zhì)瘤患者54例，均經(jīng)病理活檢確診，并符合2007年WHO腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]中的Ⅳ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中男性28例，女性26例；年齡29～67歲，平均年齡(48.7±2.5)歲。所有患者術(shù)前均未接受抗腫瘤藥物治療，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意且患者及家屬知情同意。采集患者膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織(距腫瘤組織邊緣2～3 cm)，以生理鹽水沖洗后于液氮中迅速冷凍，然后置于超低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 EGFRvⅢ在不同組織中的表達(dá)情況 取2～3 g膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織，分別加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)進(jìn)行組織勻漿，制成懸液，采用ELISA法測(cè)定懸液中EGFRvⅢ的表達(dá)量；采用免疫組化法(IHC)測(cè)定組織中EGFRvⅢ表達(dá)情況：將保存的膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織進(jìn)行石蠟包埋，制成切片后，按照IHC試劑盒說(shuō)明書操作：切片置于65 ℃水浴鍋中過(guò)夜脫蠟，于37 ℃水浴鍋中經(jīng)胃蛋白酶消化30 min，加檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，加阻斷劑作用10 min，用非免疫血清封閉后滴加抗EGFRvⅢ抗體，室溫過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗作用10 min，加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶反應(yīng)10 min，加DAB顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為0分、淺黃色為1分、深黃色為2分、棕褐色為3分；每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400)觀察陽(yáng)性細(xì)胞率，陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞率<10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；IHC評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分，其中0～4分為EGFRvⅢ低表達(dá)，5～12分為EGFRvⅢ高表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并接種于12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000將EGFRvⅢ的siRNA和陰性對(duì)照(NC)的siRNA分別轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中，分別稱為EGFRvⅢ-siRNA組和NC-siRNA組，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000將重組質(zhì)粒pcDNA4to-EGFRvⅢ和空載體對(duì)照質(zhì)粒pcDNA4to分別轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中，培養(yǎng)36 h后加入氨芐青霉素50 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)2周，分別命名為U87-EGFRvⅢ細(xì)胞和U87-control細(xì)胞。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定EGFRvⅢ-siRNA組和NC-siRNA組中膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖能力 取2組細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后棄去培養(yǎng)基，加入不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測(cè)U87-EGFRvⅢ和U87-control細(xì)胞中EGFRvⅢ表達(dá)量 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的U87-EGFRvⅢ細(xì)胞和U87-control細(xì)胞，并提取細(xì)胞蛋白。取50 μg/孔蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，加5%脫脂牛奶于室溫下封閉過(guò)夜，加入抗EGFRvⅢ抗體和抗β-actin抗體，4 ℃反應(yīng)4 h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)30 min；加入顯色劑，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)，EGFRvⅢ蛋白的相對(duì)表達(dá)量=EGFRvⅢ蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照β-actin蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 裸鼠實(shí)驗(yàn) 選取無(wú)特定病原體4～6周齡雌性Balb/c裸鼠10只，分為U87-EGFRvⅢ組和U87-control組，每組5只。分別在背部皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的U87-EGFRvⅢ和U87-control細(xì)胞，1×106個(gè)細(xì)胞/只，共飼養(yǎng)8周，以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b)，計(jì)算腫瘤體積V=a×b2/2(cm3)，每2周測(cè)量1次。8周后剝離已成瘤裸鼠的皮下腫瘤并稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織及癌旁組織中EGFRvⅢ的表達(dá)情況

膠質(zhì)瘤組織中EGFRvⅢ表達(dá)量、陽(yáng)性細(xì)胞率、染色強(qiáng)度評(píng)分、IHC評(píng)分均高于癌旁組織，且2組間差異顯著(P<0.01)，見表1。

2.2 EGFRvⅢ-siRNA組和NC-siRNA組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間OD450 nm比較

2組細(xì)胞在培養(yǎng)24～96 h時(shí)的OD450 nm值逐漸升高，但EGFRvⅢ-siRNA組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72、96 h的OD450 nm值均顯著低于NC-siRNA組，2組間差異顯著(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表1 膠質(zhì)瘤組織及癌旁組織中EGFRvⅢ表達(dá)情況

表2 EGFRvⅢ-siRNA組和NC-siRNA組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的OD450 nm比較

注：與NC-siRNA組比較，*為P<0.05，**為P<0.01。

2.3 U87-EGFRvⅢ和U87-control細(xì)胞中EGFRvⅢ表達(dá)情況

U87-control細(xì)胞中EGFRvⅢ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.09±0.01)，顯著低于U87-EGFRvⅢ細(xì)胞中的(0.73±0.19)，2組間差異顯著(P<0.01)。

2.4 裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2組裸鼠實(shí)驗(yàn)成瘤率均為100%。U87-control組和U87-EGFRvⅢ組腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量分別為(0.09±0.03)cm3和(0.51±0.24)cm3，(0.39±0.20)g和(1.12±0.15)g，U87-EGFRvⅢ組腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量顯著大于U87-control組(P<0.01)。

3 討論

人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后比較差，平均生存期僅26～52周[4]。因此，人腦膠質(zhì)瘤的治療仍是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難點(diǎn)之一，據(jù)人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。

EGFR包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化及黏附等活動(dòng)[5]。EGFR的過(guò)度表達(dá)與其基因突變或重排有關(guān)，伴有EGFR基因重排的人腦膠質(zhì)瘤患者中有50%的患者存在EGFR突變，EGFRvⅢ是其最常見的突變類型[6]。EGFRvⅢ是由EGFR胞外區(qū)801 bp的2～7外顯子缺失所致的外顯子1和外顯子8相連，在結(jié)合處形成1個(gè)新的氨基酸，致使在EGFR胞外區(qū)形成1個(gè)新的抗原決定簇，產(chǎn)生1種特異性的腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物[7-8]。EGFRvⅢ在沒(méi)有與配體結(jié)合的情況下亦可對(duì)細(xì)胞核內(nèi)多種基因的表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)分化產(chǎn)生調(diào)控作用，屬于配體非依賴性受體[9-10]。所以EGFRvⅢ可作為治療腫瘤疾病的新靶點(diǎn)。曹玉婷等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抗EGFR單克隆抗體對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有良好的抑制作用；也有相關(guān)研究表明[12-13]，EGFR抗體在治療人腦膠質(zhì)瘤中取得了一定的治療效果。本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中EGFRvⅢ表達(dá)量、陽(yáng)性細(xì)胞率、染色強(qiáng)度評(píng)分、IHC評(píng)分高于癌旁組織，說(shuō)明EGFRvⅢ在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量較多，癌旁組織表大量相對(duì)較少，提示EGFRvⅢ可能與腫瘤的發(fā)展有一定聯(lián)系；本研究中EGFRvⅢ-siRNA組細(xì)胞在培養(yǎng)24～96 h的OD450 nm值顯著低于NC-siRNA組，提示通過(guò)靶向抑制EGFRvⅢ后可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖能力；U87-EGFRvⅢ細(xì)胞中EGFRvⅢ的相對(duì)表達(dá)量顯著高于U87-control細(xì)胞；U87-EGFRvⅢ組腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量均顯著大于U87-control組。說(shuō)明高表達(dá)的EGFRvⅢ能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖，且可促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的成瘤能力，可能與EGFRvⅢ可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α等刺激性細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自發(fā)性生長(zhǎng)有關(guān)[14-15]。

綜上所述，EGFRvⅢ在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量較多，且能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖。高表達(dá)的EGFRvⅢ可促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的成瘤能力，通過(guò)靶向抑制EGFRvⅢ后可降低膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖能力，EGFRvⅢ與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。