邢維山 張錦輝 夏榮鈞 鄭琳琳 林黎娟

結(jié)直腸癌(CRC)是1種常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除是較有效的治療手段。

原癌基因DEK是由急性髓系白血病亞型中以DEK-CAN 融合蛋白的形式分離出來的[1]，它在很多實(shí)體腫瘤如肺癌、膀胱癌、肝癌、子宮頸癌以及黑色素瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)方式[2]。近些年來，DEK在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中的作用研究日益增多。研究普遍認(rèn)為DEK與細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系[3]。我們的前期研究[4]證實(shí)了DEK與子宮頸癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)，與增殖細(xì)胞標(biāo)記Ki-67蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，兩者的聯(lián)合檢測對于宮頸癌及其癌前病變的診斷具有重要的指導(dǎo)意義；另外，我們的研究也發(fā)現(xiàn)DEK與乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。本研究利用檢測109例結(jié)腸癌及癌旁正常結(jié)腸粘膜組織中DEK蛋白的表達(dá)，并分析了DEK蛋白過表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)及患者生存情況之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

隨機(jī)選取丹東市第一醫(yī)院2006至2009年期間手術(shù)治療的CRC患者109例，其中包括87例男性、22例女性，中位年齡48.6歲(34～76歲)。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)均為原發(fā)性CRC，所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療，無遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移；109例癌旁正常結(jié)腸粘膜組織及12例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織也被納入本研究。109例患者全部進(jìn)行跟蹤隨訪5年或者至死亡，隨訪結(jié)束時(shí)有77位患者生存。本研究經(jīng)得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會許可。

腫瘤部位：結(jié)腸和回盲部57例，直腸52例；腫塊直徑≤ 5 cm者61例、>5 cm者48例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例；侵及漿膜者52例；高分化49例，中、低分化60例；按AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期14例、Ⅱa期38例、Ⅱb 期4例、Ⅲa期7例、Ⅲb期28例、Ⅲc期15例。

1.2 免疫組化染色

SP法進(jìn)行免疫組化染色。組織芯片脫蠟、水化，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中修復(fù)，PBS漂洗，置入30 ml/ L H2O210 min，正常血清37 ℃孵育15 min，加入抗 DEK 單克隆抗體(美國BD公司，1∶50 稀釋)后在4 ℃冰箱內(nèi)孵育并過夜，再加入生物素標(biāo)記抗IgG抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗IgG抗體(北京中杉公司)經(jīng)過37 ℃孵育60 min后，用DAB進(jìn)行顯色以及蘇木精復(fù)染，最后中性樹膠封片。由光學(xué)顯微鏡判斷結(jié)果著色情況，DEK表現(xiàn)為核染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。DEK蛋白表達(dá)率與臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系由卡方檢驗(yàn)；術(shù)后生存率用Kaplan-Meier和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析。P<0.05視為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 DEK 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸組織類型的關(guān)系

53例CRC(48.6% )、10例(9.2%)癌旁正常組織、8例(66.7%)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，采用免疫組化染色檢測可見細(xì)胞核DEK表達(dá)。結(jié)直腸癌組織中DEK蛋白表達(dá)與癌旁良性組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織及癌周組織比較均有明顯差異(P均<0.001)，癌組織與淋巴結(jié)組織之間比較無相關(guān)性(P=0.237)。

2.2 DEK表達(dá)與臨床病理學(xué)及預(yù)后的關(guān)系

將DEK表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系見表1，DEK蛋白表達(dá)與腫瘤大小、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜侵犯和腫瘤分期有相關(guān)性(P分別為 0.029、0.009、0.006、0.031和0.010)，但與年齡、性別及部位無關(guān)。另外，DEK呈陽性表達(dá)的CRC與陰性表達(dá)的CRC相比，生存率明顯降低，P=0.025(圖1)。

表1 DEK蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系/例

圖1 Kaplan-Meier方法分析圖

2.3 DEK表達(dá)與組織分級、漿膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共同對CRC預(yù)后的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)DEK表達(dá)在CRC進(jìn)展中的重要作用，比較了它與其它影響CRC進(jìn)展的因素在評估預(yù)后中的作用，其中年齡、組織分級、漿膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期都與患者5年生存率有相關(guān)性(P分別為0.002、0.016、0.003、0.002和<0.001)。通過聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，組織分級低且伴DEK表達(dá)的CRC比組織分級高但不伴DEK表達(dá)的CRC 5年生存率高(P<0.001)；有漿膜浸潤且伴DEK表達(dá)的CRC比有漿膜浸潤但不伴DEK表達(dá)CRC的5年生存率低(P=0.005)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC 5年生存率與是否伴DEK表達(dá)有相關(guān)性(P=0.009)。

2.4 DEK表達(dá)與腫瘤分期對CRC預(yù)后的影響

腫瘤分期是CRC最重要的組織學(xué)預(yù)后影響因素，運(yùn)用Cox進(jìn)行的多變量生存分析顯示(表2)，腫瘤分期是CRC總生存率獨(dú)立影響因素(P=0.0042)。高分期且伴DEK表達(dá)的CRC5年生存率最低，明顯低于低分期且伴DEK表達(dá)的CRC (P=0.001)；同是高分期的CRC，伴有和不伴有DEK表達(dá)的5年生存率顯著不同(P=0.035)。

表2 多因素分析109例CRC患者的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素

3 討論

DEK蛋白是1種核磷酸化蛋白，DEK的磷酸化是1種重要的翻譯后修飾，且磷酸化水平高低與細(xì)胞凋亡程度密切相關(guān)。有研究表明，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)DEK 的磷酸化水平明顯降低[7]。Wise-Draper等[8]認(rèn)為，DEK過表達(dá)可以抑制HeLa細(xì)胞的衰老，當(dāng)HeLa細(xì)胞內(nèi)的DEK敲除后會抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡。DEK作為原癌基因在許多惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平明顯影響患者的預(yù)后狀況，可以用來評估膠質(zhì)瘤和子宮頸癌的分化程度[9]。

CRC是世界范圍內(nèi)常見的致死性的惡性腫瘤，其5年總生存率約65%，腫瘤分期是影響預(yù)后的最重要的因素。盡管外科手術(shù)為CRC提供了較有效的治療，但CRC患者的前景仍然很值得擔(dān)憂，因此，認(rèn)識更多預(yù)見不良預(yù)后的分子標(biāo)志物有利于提高患者的治療效果。本研究中我們發(fā)現(xiàn)DEK在近二分之一的CRC中呈高表達(dá)，且其表達(dá)與組織分級、腫瘤大小、漿膜侵犯、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們的結(jié)果證實(shí)DEK表達(dá)情況聯(lián)合這些指標(biāo)的檢查更加有利于CRC預(yù)后的評估。

腫瘤分期是CRC預(yù)后不良的重要的組織學(xué)特征之一，我們證實(shí)高分期中的DEK表達(dá)比低分期的CRC接近3倍，且分期高的CRC 5年生存率較低，更重要的是，細(xì)胞分期高且伴有DEK表達(dá)的CRC 5年生存率較不伴有DEK表達(dá)的CRC低，這些結(jié)果說明，腫瘤分期與DEK表達(dá)共同預(yù)示患者的生存情況。另外，腫瘤分期是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后影響因素，我們也證明DEK表達(dá)與高分期CRC的不良預(yù)后有關(guān)。因此可以推測DEK 蛋白對評估CRC預(yù)后有一定的參考價(jià)值，相信通過進(jìn)一步研究 DEK 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制，將會為臨床CRC的預(yù)后評估及分子靶向治療提供有價(jià)值的依據(jù)。