王 建

在世界大部分地區(qū)，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是1種罕見的惡性腫瘤，但是在東南亞、北非和我國南方(尤其是廣東省)其發(fā)病率顯著增高，國內(nèi)稱之為“廣東癌”[1]。鼻咽癌惡性程度較高，易于轉(zhuǎn)移且預(yù)后不良[2]。Nur77是1個孤兒核受體家族成員，參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。為了探討Nur77在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中的作用及機制，本研究構(gòu)建綠色熒光蛋白標(biāo)記的Nur77基因慢病毒表達載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2Z細胞，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(Thermo)；T4 DNA連接酶(Thermo)；DNA回收試劑盒(Magen)；KOD Plus DNA聚合酶(TOYOBO)；cloneez無縫重組試劑盒(金斯瑞)；質(zhì)粒抽提試劑盒(康為)；LipofectaminTM3000(Invitrogen)；FItran：慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑(輝駿生物)；Trypsin-EDTA(MP)；Polybrene(輝駿生物)；Pyrex?cloning cylinder(Sigma)。

1.2 質(zhì)粒及細胞株

XL1-BLUE MRF'感受態(tài)細胞(輝駿生物)；慢病毒表達載體：pCDH-EGFP-G4S-MCS(輝駿生物)；慢病毒包裝質(zhì)粒：pMD2.G、psPAX2(輝駿生物)；HEK293T及CNE-2Z細胞。

1.3 方法

1.3.1 制備目的基因片段 根據(jù)人Nur77全長序列設(shè)計引物，上游引物為：5'-AATGAATTCGAATGCCCTGTATCCAAGCCCAA -3'，含EcoRI酶切位點；下游引物為：5'-AATGGATCCTCAGAAGGGCAGCGTGTCCATG-3'，含BamHI酶切位點。PCR反應(yīng)體系如下：上下游引物各1 μl(10 μmol/L)、模板cDNA 1 μl、KOD Plus DNA聚合酶0.5 μl、10×聚合酶buffer 2 μl、ddH2O 12.5 μl、dNTP 2 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共25個循環(huán)；68 ℃ 5 min。擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段。

1.3.2 構(gòu)建重組表達載體 用EcoRI和BamHI酶切載體和片段，反應(yīng)體系如下：10×buffer 6 μl、載體/基因片段10 μl、EcoRI酶 1 μl、BamHI酶1 μl、ddH2O 42 μl，于37 ℃酶切3 h，回收酶切后的質(zhì)粒和基因片段；線性化質(zhì)粒和基因連接，反應(yīng)如下：基因片段2 μl、線性化載體3 μl、T4連接酶1 μl、10× T4 Buffer 2 μl、ddH2O 12 μl，16 ℃連接過夜。

1.3.3 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞及菌落檢測 感受態(tài)細胞加入10 μl DNA混勻，冰浴30 min；轉(zhuǎn)化管于42 ℃循環(huán)水浴鍋中熱激90 s后冰浴3 min；每管加入500 μl SOC液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，使細菌復(fù)蘇；菌液涂抹培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落置于液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌；做菌落PCR檢測陽性克?。惶羧尉鋼u菌后抽提質(zhì)粒，酶切驗證是否得到陽性克?。魂栃钥寺∷蜏y序驗證。

1.3.4 慢病毒包裝及滴度測定 20 μl包裝質(zhì)粒和4μg慢病毒表達質(zhì)粒在400 μl 0.9%(w/v)生理鹽水中混合，并加入50 μl轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育20 min后加入到培養(yǎng)293T細胞的100 mm皿中；轉(zhuǎn)染后48 h和72 h分別收集上清，3 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清用0.45 μm微孔濾器過濾；離心管底鋪上2～4 ml 20%(w/v)蔗糖-PBS溶液,緩慢加入慢病毒上清液，50 000 g超速離心濃縮2 h，用250～500 μl PBS重溶；逐孔稀釋法進行慢病毒滴度測定。

1.3.5 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 CNE-2Z細胞以2×104/孔接種至24孔板；取兩孔細胞分別加入25 μl的pCDH-EGFP-G4S-Nur77病毒液和pCDH-EGFP-G4S-MCS對照病毒液；感染48h后，于熒光顯微鏡下觀察感染效果；在6孔板中按20、50、100、200、500、1000接種感染細胞，培養(yǎng)7～12天后觀察克隆形成情況；鏡下將發(fā)光細胞群找到，用記號筆在培養(yǎng)皿底部劃定范圍做記號；用sigma公司克隆環(huán)套住記號筆畫圈范圍的克隆，向克隆環(huán)中加60～70 μl胰酶消化，傳到新的96孔板培養(yǎng)孔中培養(yǎng)；一周后觀察并標(biāo)記單克隆孔；當(dāng)單克隆孔長至孔面積的1/5時，選擇均為陽性(通過熒光判斷)的單克隆孔，消化再培養(yǎng)，長滿后移到24孔中繼續(xù)培養(yǎng)；Western blot進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的Nur77蛋白表達水平檢測。

2 結(jié)果

2.1 pCDH-EGFP-G4S-Nur77過表達載體的構(gòu)建

以CNE-2Z細胞cDNA為模板的PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見大小約為1 700 bp的特異性擴增條帶，與預(yù)期一致(圖1)。菌落PCR及酶切鑒定選出陽性克隆，將以陽性克隆為模板擴增出的基因片段進行測序，目標(biāo)基因序列進行同源性分析對比，同源性100%，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Nur77基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 慢病毒滴度測定

接種病毒48 h后觀察熒光表達情況，病毒原液的滴度值=熒光細胞個數(shù)/稀釋后的病毒量。實驗和對照病毒滴度均超過1×10-8Tu/ml。

2.3 過表達Nur77的穩(wěn)轉(zhuǎn)CNE-2Z細胞株的建立及蛋白表達檢測

通過病毒感染及熒光篩選，獲得了穩(wěn)定表達Nur77的細胞株。熒光顯微鏡觀察可見，發(fā)熒光的細胞與明場視野下細胞相一致(圖2)。Western blot結(jié)果顯示(圖3)，與轉(zhuǎn)染空載體組相比較，本底Nur77的蛋白水平無顯著差異，而融合蛋白在空載體組無表達而在Nur77組高表達，提示Nur77成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE-2Z細胞株。

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的熒光顯微鏡觀察

圖3 轉(zhuǎn)染的CNE-Z細胞Western blot檢測

3 討論

Nur77是1個核轉(zhuǎn)錄因子，在細胞增殖、凋亡、遷移等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要影響[5]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，Nur77具有雙重作用。一方面，作為轉(zhuǎn)錄因子，其能上調(diào)多種基因表達促進細胞的增殖與遷移，抵抗凋亡；另一方面，其蛋白本身的亞細胞定位變化如定位到線粒體可誘導(dǎo)凋亡[6]。而我們的研究方向，是探討Nur77通過作用于微管蛋白調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞遷移、侵襲的分子機制。因此，構(gòu)建Nur77與熒光蛋白融合表達質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株能更好的反映目的蛋白的亞細胞定位及與相關(guān)蛋白的相互作用。

質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的效率雖然高，但轉(zhuǎn)染后目的基因很少能整合進入基因組，因此不適合穩(wěn)定株的篩選[7]。慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因載體。它是1種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能使外源基因整合入宿主基因組并穩(wěn)定、長期表達，但卻比一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體同時轉(zhuǎn)染包裝細胞，即可進行病毒的包裝，而后經(jīng)收集和濃縮的慢病毒液可以直接用于感染宿主細胞[8]。本研究成功構(gòu)建了綠色熒光蛋白標(biāo)記的Nur77慢病毒表達載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE-2Z細胞，為進一步研究Nur77亞細胞定位改變及對微管功能的調(diào)控奠定了前期實驗基礎(chǔ)。