鄭明 黃晶晶 于皓 程輝

1. 350004 福州， 福建省高?？谇会t(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；2. 福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

白色念珠菌(Candidaalbicans)是一種寄生在人體的機(jī)會性致病真菌。近年來，隨著類固醇激素等廣泛應(yīng)用，使臨床上念珠菌感染日益增多[1-2]。研究表明65%以上義齒佩戴者患有念珠性口炎[3]，而白色念珠菌與念珠菌性口炎的發(fā)生密切相關(guān)[4]，其在患者的義齒菌斑中檢出率81.7%，是主要的致病菌[5]。據(jù)調(diào)查，白色念珠菌也是臨床感染率最高的真菌[6]。

茶葉作為純天然的藥物，飲茶的好處與人類健康的關(guān)系已有多方面研究。目前，對于茶葉的抗氧化活性[7]、抗癌活性[8-9]、抗微生物活性包括抗菌和抗病毒活性已廣泛有報(bào)道[10-14]。關(guān)于茶葉抗真菌活性報(bào)道較有限。

據(jù)研究，綠茶的兒茶素，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)具有抗真菌活性[15]。EGCG為一種抗葉酸化合物，可以擾亂白色念珠菌的葉酸代謝，從而達(dá)到抑真菌作用[16-17]。Sitheeque等[18]指出，紅茶多酚(兒茶素和茶黃素)也顯示抑制白色念珠菌能力。目前較多的究局限在對茶葉中的某一成分進(jìn)行抗真菌研究，而以簡單方法制取茶浸泡液對抗真菌是否有效鮮有報(bào)道。

同時，現(xiàn)有的義齒清潔劑對抗白色念珠菌效果有限[19]。所以，本實(shí)驗(yàn)通過3 種不同濃度的茶浸泡液對白色念珠菌的抑菌活性進(jìn)行初步研究，為進(jìn)而研究茶浸泡液是否能對義齒表面上真菌膜有清除作用做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌株與茶葉 白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC90029，上海瑞楚生物科技有限公司)；白茶(AnG,浙江安吉)、鐵觀音(TM，福建安溪)、大紅袍(HM，福建武夷山)。

1.1.2 主要試劑與儀器 培養(yǎng)基：瓊脂粉(BIOSHARP)；液體沙氏培養(yǎng)基(青島海博)；革蘭染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；紫外分光光度計(jì)(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

取20 g茶葉放入100 ml一級水(80～85℃)浸泡10 min，濾紙過濾，使用0.2 μm過濾器獲得200 mg/mL無菌茶浸泡液。

采用對倍稀釋法，用等量的沙氏液體培養(yǎng)基和等量的茶浸泡液混合配制成系列濃度對倍遞減的茶浸泡液，再分別取上述系列濃度的茶浸泡液1 ml與 9 ml沙氏瓊脂培養(yǎng)基混合后傾注平板。茶浸泡液平板濃度：20、10、5、2.5、1.25 mg/mL。每組平板樣本量為10 個。

菌懸液配制：將白色念珠菌接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取部分菌落革蘭染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)，鏡檢為純培養(yǎng)后挑取純培養(yǎng)單菌落接種在沙氏液體培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫?fù)u床28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)24 h。離心(3 500 r/min，4 ℃，10 min)，棄上清液，PBS洗滌3 次。最后沉淀物用PBS稀釋，配制104CFU/mL白色念珠菌菌懸液備用。取5 μl菌懸液分別點(diǎn)種于所有平皿表面，放入恒溫培養(yǎng)箱在 37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，記錄觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，茶浸泡液抗菌活性采用單因素方差分析以及兩兩比較(以α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水平)。兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD法)。

2 結(jié) 果

以蒸餾水平板為空白對照組，除了10 mg/mL HM浸泡液平板菌落計(jì)數(shù)大于蒸餾水外，其余茶浸泡液平板均小于空白組。但只有10 mg/mL AnG浸泡液(P=0.025), 2.5 mg/mL HM浸泡液(P=0.046)與空白組之間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對白色念珠菌有抑制作用，其余茶浸泡液與空白組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 1)。

組別平板濃度(mg/mL)細(xì)菌計(jì)數(shù)(1×104CFU/mL)空白組1.05±0.40AnG1.250.93±0.18AnG2.50.92±0.25AnG50.90±0.19AnG100.78±0.19①AnG200.97±0.18TM1.250.89±0.16TM2.50.95±0.31TM50.85±0.15TM100.80±0.26TM200.82±0.31HM1.250.83±0.20HM2.50.79±0.20①HM50.95±0.28HM101.10±0.31HM201.01±0.21

注： 與空白組比較，①P<0.05

3 討 論

調(diào)查結(jié)果顯示念珠菌感染占真菌感染的73.4%，其中白色念珠菌感染最為常見[20]。

本研究選擇未發(fā)酵綠茶類中的安吉白茶，半發(fā)酵烏龍茶類中的鐵觀音、大紅袍作為研究對象。選擇這3 種茶葉是Chen等[21]對23 種茶浸泡液抗白色念珠菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這3 種茶葉有一定的抗真菌活性。

為尋找對義齒表面上真菌膜有清除作用的茶浸泡液，本實(shí)驗(yàn)對這3 種茶葉的抗菌性進(jìn)一步驗(yàn)證。與Chen等[21]采用的研究方法不同，采用藥物敏感實(shí)驗(yàn)瓊脂稀釋法，并嘗試更多不同茶浸泡液濃度進(jìn)行抗白色念珠菌實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置1.25、2.5、5、10、20 mg/mL 5 種跨度較大等比系列茶葉濃度，試圖找到抑制白色念珠菌的最佳茶葉濃度。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)10 mg/mL AnG浸泡液, 2.5 mg/mL HM浸泡液對白色念珠菌有抑制作用，其余茶浸泡液及不含茶浸泡液對白色念珠菌的生長無顯著影響。 Chen等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果這3 種茶葉在1.25 mg/mL時達(dá)到50%白色念珠菌抑制率。推測可能是因?yàn)椴捎玫难芯糠椒ú灰粯?，該學(xué)者采用液體法，本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂稀釋法，以及茶浸泡液制取方法不一樣導(dǎo)致結(jié)果差異。

通過本研究了解到茶葉浸泡液對白色念珠菌有一定抑制作用，喝茶或用茶清洗口腔，可能有助于減少口腔真菌感染。茶提取物可能是潛在義齒消毒產(chǎn)品的原材料。另外，茶浸泡液對白色念珠菌的抑菌作用與濃度有關(guān)，且抑菌能力不隨濃度增加而增強(qiáng)。可對不同濃度的茶浸泡液抑菌活性進(jìn)一步研究。