曾雪花高旭龍王吟方亭劉玉清趙阿勇何珂

(1.浙江農林大學動物科技學院，臨安，311300；2.浙江省長興太湖龍之夢動物世界文化旅游開發(fā)有限公司，長興，313100)

毛霉菌病是繼念珠菌病和曲霉菌病之后，第三類最常見的侵襲性真菌性疾病。當機體免疫功能降低時毛霉菌(Mucorvarians)可直接侵入支氣管和肺，或經血行及淋巴管播散侵入，其菌絲侵犯血管引起血栓形成和梗死，產生急性炎癥[1]。目前在人、豬、馬、羊、狗、貓、鳥類、袋鼠和一些實驗動物都有感染發(fā)病的報道[2-3]，但對于熊等大型哺乳動物感染毛霉菌的情況還未見報道。2018年1月浙江長興太湖龍之夢動物園的數只黑熊先后發(fā)生皮膚增厚、大面積脫毛現象。本文對患病個體所采集的病灶進行病理學觀察，并進行了藥敏試驗和轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)等序列分析，構建了系統(tǒng)進化樹，旨在為患病個體的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

浙江省長興縣龍之夢動物園黑熊(Ursusthibetanus)患病處皮屑。將皮膚病灶及周圍酒精消毒后，用一次性滅菌刀片刮取皮屑，裝入滅菌EP管中，送實驗室分離培養(yǎng)。

1.2 臨床癥狀

患病黑熊精神食欲正常，患處有癢感，常在墻壁和樹干上摩擦，導致皮膚增厚、大面積脫毛、有皮屑(圖1)。

圖1 患病的熊皮膚表面(A)和(B)及培養(yǎng)后得到的菌落圖(C)和(D)Fig.1(A)(B)the surface of sick bear and(C)(D)the colonies after cultivation

1.3 真菌分離培養(yǎng)

將皮屑加1 mL滅菌PBS吹打后，接種于SDA培養(yǎng)基上(蛋白胨10 g，瓊脂20 g，葡萄糖40 g，加蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌20 min，倒板備用)。于37℃培養(yǎng)24 h后可見明顯菌落。

1.4 菌株抗藥敏試驗

采用ROSCO紙片擴散法，藥物包括5-氟胞嘧啶，兩性霉素B，氟康唑，伊曲康唑和酮康唑，均為成品藥敏片。另于藥店購買達克寧硝酸咪康唑乳膏和曲安奈德益康唑乳膏，檢測硝酸咪康唑和硝酸益康唑對于該真菌是否具有抑制作用。其中膏狀藥品自制藥敏片過程如下：取1 g藥膏溶解至10 mL水中，取1 mL配置好的藥液浸入已滅菌的含100片紙片的小瓶中，置冰箱內1～2 h取出烘干，并置冰箱中保存?zhèn)溆?。計算藥敏片濃度?0 μg/片硝酸咪康唑(達克寧硝酸咪康唑乳膏)和10 μg/片硝酸益康唑(曲安奈德益康唑乳膏)。

藥敏試驗：用無菌棉簽將0.5麥氏單位菌液均勻涂布于SDA培養(yǎng)基上，待平板表面干后貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌環(huán)直徑(抑菌環(huán)邊緣少量菌落生長忽略不計)。藥敏紙片法參考標準敏感≥21 mm，耐藥≤10 mm(由Rosco公司提供參考標準)。

1.5 菌株形態(tài)學鑒定

收集菌體，采用乳酸棉酚藍染液染色，光學顯微鏡觀察。

1.6 菌株分子生物學鑒定

在SDA平板上擴培的真菌制成孢子懸液，采用將真菌通用引物擴增(18S區(qū)段：NS3(5′-GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3′)和NS24(5′-AAACCTTGTTACGACTTTTA-3′)，28S區(qū)段：NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)，ITS區(qū)段：ITS1(5′-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應體系為30 μL，反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析，片段大小符合目的的PCR產物送杭州鉑尚測序公司測序。

將測序結果在GenBank中通過BLAST進行比對，以獲得相似度較高的序列，再與所測序列通過MegAlign進行比對，結果利用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類地位。

2 結果

2.1 真菌分離培養(yǎng)

從患病的熊皮膚表面(圖1-A和B)共收集4份病料，其中只有2份在SDA培養(yǎng)基上長出明顯的帶有菌絲的菌落，而其余2份僅出現疑似細菌的菌落。疑似為真菌的樣品所獲得的菌落形態(tài)相近(圖1-C和D)，因此隨機選擇一個進行下面的試驗。

2.2 抗藥敏試驗

藥敏試驗結果表明該真菌對伊曲康唑和兩性霉素B高度敏感；對酮康唑中度敏感；對氟康唑和氟胞嘧啶耐藥(表1)。而采用的2種膏狀藥物中，該真菌對達克寧硝酸咪康唑乳膏敏感，而對曲安奈德益康唑乳膏效果中介(表1)。

表1 采用的藥敏紙片濃度和抑菌效果

Tab.1 The concentration of drug paper and the antibacterial effect

2.3 形態(tài)學觀察

該菌在SDA培養(yǎng)基上生長迅速，在37℃培養(yǎng)48 h后可長滿整個培養(yǎng)基(25 cm)，肉眼可見明顯的絲狀型菌落(圖1-C和D)。顯微鏡下觀察發(fā)現由許多菌絲體和分生孢子，孢囊梗分枝，頂端形成球形或近球形的孢子囊，孢子囊孢子多呈球形、有厚壁孢子(圖2)。根據在PDA培養(yǎng)基的生長特點及鏡下形態(tài)學檢查，初步鑒定為毛霉科(Mucoraceae)真菌。

圖2 乳酸棉酚藍染液染色后光學顯微鏡下真菌形態(tài)。放大倍數分別為(A)10×10和(B)40×10Fig.2 The morphology of fungal under optical microscopeafter dying of lactophenol cotton blue.The magnification timesin A and B are 10×10 and 40×10，respectively

2.4 分子生物學鑒定

本研究選取18S區(qū)段、28S區(qū)段和ITS區(qū)段進行測序。根據NCBI Blast結果顯示，該菌推測為橫梗霉屬(Lichtheimia)或犁頭霉屬(Absidia)，采用ITS、28S和18S區(qū)段進行系統(tǒng)樹分析，其中ITS分析過程中參與比對的序列如下：Lichtheimiaramosa(GenBank：HQ285700、FJ719386)，Lichtheimiaomata(GenBank：GQ342891)，Absidiacorymbifera(GenBank：AY944895、DQ118985和DQ118982)，Lichtheimiasphaerocystis(GenBank：GQ342900和GQ342899)，以Fennellomyceslinderi(GenBank：GQ249890)為外類群。28S系統(tǒng)樹構建過程中參與比對的序列如下：Lichtheimiaramosa(GenBank：GQ342953和GQ342940)，Absidiacorymbifera(GenBank：AF113445)，Absidiahyalospora(GenBank：EU826368)，Absidiablakesleeana(GenBank：AF157171)，Lichtheimiacorymbifera(GenBank：GQ342932、FJ719444和GQ342910)，以Paecilomyceslilacinus(GenBank：AY213717)為外類群。18S系統(tǒng)樹構建過程中參與比對的序列如下：Lichtheimiaramosa(GenBank：JQ004932)，Absidiacorymbifera(GenBank：AF113407)，Absidiablakesleeana(GenBank：AF157117)，Lichtheimiacorymbifera(GenBank：HM590658、KJ123705和HM590662)，以Dichotomocladiumrobustum(GenBank：JQ775466)為外類群。

聚類結果顯示，樣品中獲得的菌株(Strain)在28S和ITS分析結果中，和Lichtheimiaramosa聚集在一起，支持率分別為89%和100%，但在18S的分析結果中，和Lichtheimiacorymbifera聚類在一起(圖3)。Lichtheimiacorymbifera和Lichtheimia在2009年被認為認為是傘枝橫梗霉的兩個種。

圖3 (A)28S、(B)ITS和(C)18S序列的系統(tǒng)進化樹 節(jié)點上的數字代表為5000次時的支持率Fig.3 Phylogenetic tree of(A)28S，(B)ITS and(C)18S.The number on the node represents the supporting rate of 5000 times

3 討論

毛霉菌病是由于感染毛霉菌目而機會性感染形成，在人群中和其相關的重要的免疫抑制條件包括糖尿病、血液惡性腫瘤、移植受者使用糖皮質激素等免疫抑制劑和嚴重燒傷等情況[4]。由于免疫抑制劑使用的不斷增加，毛霉菌病變得越來越普遍，人類患者出現較高死亡率，往往在50%以上[5]。較為常見的毛霉菌有根霉菌屬(Rhizopus)、毛霉菌屬和犁頭霉屬。根據生理學特征、系統(tǒng)發(fā)生和形態(tài)學數據分析，認為犁頭霉屬的傘狀犁頭霉(Absidiacorymbifera)、Absidiablakesleeana和Absidiahyalospora應該被重新分類為一個單獨的科Lichtheimiaceae fam.nov.。因此應該訂正為Lichtheimiacorymbifera，Lichtheimiablakesleeana和Lichtheimiahyalospora[6]。研究發(fā)現一些曾被報道為Lichtheimiacorymbifera的案例，可能為橫梗霉(Lichtheimiaramosa)[7]。2012年，香港大學發(fā)現了新型的毛霉菌，命名為香港型橫梗霉菌(Lichtheimiahongkongensis)，嚴重更可致命[8]。

黑熊毛霉病目前尚未見報道，本研究通過病料鏡檢及分離、純化培養(yǎng)，真菌形態(tài)學特征對病原真菌作出初步分類鑒定。真菌的ITS序列具有高度的保守性，常作為真菌近似種及亞種的鑒別依據，通過與GenBank數據庫進行真菌ITS序列同源性比較并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。根據顯微鏡圖片中存在分叉的孢囊柄(圖2)，并且結合ITS和28S的結果(圖3-A和B)，推測該菌株為橫梗霉。盡管在聚類分析結果中，18S的結果認為待檢菌株和Lichtheimiacorymbifera較為接近，但ITS序列在鑒定菌種時比18S和β-action更加可靠，因此我們采用ITS和28S的分析結果。

推測認為浙江北部山區(qū)空氣濕度較大，適合真菌類病原體的生長，再加上黑熊個體剛經歷了長時間的運輸，熊仔抗病能力差等因素，容易感染真菌，但目前個體精神狀態(tài)良好，飲食無明顯影響，因此建議采用外用抗真菌藥物治療。藥敏試驗結果表明，該真菌對伊曲康唑和兩性霉素B高度敏感；對酮康唑中度敏感；對氟康唑和氟胞嘧啶耐藥。這提示我們在臨床治療皮膚真菌感染時，應該充分考慮到病原的多樣性，及時進行病原菌的分離及藥敏試驗，針對性用藥。在試驗中我們同樣也進行了達克寧硝酸咪康唑乳膏和曲安奈德益康唑乳膏的藥敏試驗，結果顯示前者為敏感，可以考慮用于治療。