劉方慶 胡夢(mèng)英 文隴英

(西南山地瀕危鳥類保護(hù)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，樂山，614000)

燕科(Hirundinidae)鳥類隸屬于雀形目(Passeriformes)，分布在中國(guó)的有4屬12種，分別為河燕屬Pseudochelidon(如白眼河燕P.sirintarae等)，沙燕屬Riparia(如崖沙燕R.riparia等)，燕屬Hirundo(如家燕Hirundorustica等)和毛腳燕屬Delichon(如煙腹毛腳燕D.dasypus等)；雨燕科(Apodidae)鳥類隸屬于雨燕目(Apodiformes)，分布在中國(guó)的有5屬9種，分別為金絲燕屬Aerodramus(如短嘴金絲燕Ae.brevirostris等)，針尾燕屬Hirundapus(如白喉針尾雨燕Hirundapuscaudacutus等)，棕雨燕屬Cypsiurus(如棕雨燕C.balasiensis等)，高山雨燕屬Tachymarptis(如高山雨燕T.melba等)以及雨燕屬Apus(如白腰雨燕Ap.pacificus等)。

傳統(tǒng)的宏觀分類學(xué)認(rèn)為燕科和雨燕科分別隸屬于雀形目和雨燕目，其分類依據(jù)是兩者之間的形態(tài)特征和羽色特點(diǎn)等；有關(guān)鳥類分類及進(jìn)化的結(jié)果多是從形態(tài)結(jié)構(gòu)生理特征等方面獲得的，由于學(xué)者們對(duì)許多動(dòng)物表型特征觀點(diǎn)的不一致，許多問題并沒有形成統(tǒng)一的結(jié)果而未能得到解決[1-2]，例如，淡腰金絲燕(Aerodramusgermani)屬雨燕目雨燕科金絲燕屬，又名戈氏金絲燕，是纖小(12 cm)的深色金絲燕，尾略呈叉形，上體黑褐，腰灰白、色淡，而尾部色深，下體灰褐，腹部具淺色橫斑；國(guó)內(nèi)幾乎沒有淡腰金絲燕的影像資料，有些學(xué)者把此種歸入爪哇金絲燕下的亞種Aerodramusfuciphagagermani[3-4]。但是另外一些學(xué)者將金絲燕屬(如淡腰金絲燕(又名戈氏金絲燕))歸為Collocaliagermani[5]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子進(jìn)化已成為近年來進(jìn)化生物學(xué)研究中的一個(gè)重要方面，而分子生物學(xué)手段的應(yīng)用可以為解決這一問題提供很重要的佐證[6]。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)是動(dòng)物細(xì)胞核外DNA，具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，母系遺傳，進(jìn)化速率快，缺少重組等特點(diǎn)，已經(jīng)成為群體遺傳結(jié)構(gòu)、地理變異、系統(tǒng)發(fā)育等研究領(lǐng)域的有效分子標(biāo)記[7-9]。常用來作為系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)地理研究標(biāo)記的基因有Cytb，COI(線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅰ)，12S rRNA，16S rRNA以及ND2、 ND3等基因。其中細(xì)胞色素b(Cytochromeb，Cytb)基因的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA 的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中被了解的最為清楚，且進(jìn)化速度適中，因此是鳥類分子系統(tǒng)發(fā)育中常用的遺傳標(biāo)記之一[10]。已有的研究結(jié)果顯示，Cytb基因的種間分歧度為1%～10%，這一分歧度既能區(qū)別物種，又可忽略多重替換[11]。近年來利用線粒體基因?qū)Σ煌锓N的系統(tǒng)發(fā)育研究已經(jīng)越來越成熟和普遍。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)燕科鳥類多集中在繁殖生態(tài)和繁殖習(xí)性等方面[12-14]。對(duì)雨燕科鳥類尤其是金絲燕屬鳥類的研究多集中在燕窩的營(yíng)養(yǎng)成分品質(zhì)鑒定以及回聲定位機(jī)制等方面。如研究者利用Cytb、ND2、COI、12S rRNA等條形碼序列，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)32種不同國(guó)家和不同品種的燕窩商品進(jìn)行了品質(zhì)鑒別，并探討不同種類燕窩的品質(zhì)分類關(guān)聯(lián)，為燕窩的品質(zhì)鑒定提供更為全面的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)葉葉[15]等對(duì)燕窩的來源、營(yíng)養(yǎng)成分和主要活性物質(zhì)、功能作用等問題進(jìn)行了綜述，并總結(jié)了燕窩摻偽的鑒別方法：理化鑒定、光譜鑒定、生物鑒定及其他儀器鑒別法[15-16]。此外，一些學(xué)者對(duì)短嘴金絲燕回聲定位機(jī)制及其歸巢行為進(jìn)行了研究，初步闡明了此物種回聲定位的叫聲類型和頻率波段范圍[17-18]。然而對(duì)于燕科和雨燕科系統(tǒng)發(fā)育及其親緣關(guān)系的研究在國(guó)內(nèi)幾乎未見報(bào)道。

本文通過選擇物燕科和雨燕科共13個(gè)物種，其中雀形目燕科8種，雨燕目雨燕科5種，以線粒體基因Cytb作為分子標(biāo)記，通過分子生物學(xué)手段對(duì)燕科和雨燕科部分鳥類進(jìn)行重建系統(tǒng)發(fā)育樹，以驗(yàn)證分子生物學(xué)分類結(jié)果是否與宏觀形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致。

1 研究方法

從NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站中下載燕科和雨燕科13個(gè)物種線粒體Cytb序列，所獲得的物種NCBI序列號(hào)見表1。數(shù)據(jù)處理：用Bioedit[19]軟件將所有序列進(jìn)行多重比對(duì)后去掉兩端多余部分，裁剪整齊，得到序列長(zhǎng)度為999 bp，然后保存為.pir文件，再將此文件導(dǎo)入軟件DanSP 5.0[20]中，通過此軟件生成.nex單倍型文件。采用貝葉斯推論法(Bayesian Inference)和最大似然法(ML，Maximum Likelihood)以雁形目(Anseriformes)鴨科(Anatidae)雁屬(Anser)灰雁(Anseranser)作為外群對(duì)燕科和雨燕科13個(gè)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹重建。通過MrModeltest 2.3[21]軟件檢驗(yàn)得到貝葉斯和最大似然法的最適模型為GTR+I+G。在MrBayes[22]中對(duì)Cytb設(shè)置 1百萬代運(yùn)行(至sd<0.01)，分析樹時(shí)均舍棄前2500顆(burnin=2500)。在PAUP 4.10[23]軟件中運(yùn)行ML樹，設(shè)置重復(fù)1000代。得到的樹文件(.tre)通過Figtree[24]軟件查看并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)支持率的設(shè)置，然后導(dǎo)出圖片格式保存。物種兩兩之間的遺傳距離通過MEGA 6[25]中的p遺傳距離方法計(jì)算。

表1 燕科和雨燕科部分鳥類NCBI序列號(hào)

Tab.1 The NCBI sequence number of species for part ofHirundinidae and Apodidae

2 結(jié)果

2.1 堿基組成

燕科和雨燕科13種鳥類Cytb片段經(jīng)過比對(duì)裁剪最后得到序列長(zhǎng)度為999 bp(表2)。4種堿基含量平均分別為：A(27.707%)、T(24.544%)、C(34.306%)以及G(13.443%)。從堿基組成偏向性來看，A+T 含量(52.251%)略高于G+C 含量(47.749 %)(表2)。

表2 燕科、雨燕科13種鳥類Cyt b堿基含量

Tab.2 The contents of base pair for Hirundinidae and Apodidae

續(xù)表2

將比對(duì)并裁剪后的序列進(jìn)行Modeltest檢驗(yàn)后得到最大似然法(ML)和貝葉斯推論法(BI)的最適核苷酸替代模型為GTR+I+G。其中4種堿基頻率分別為A(0.3157)、T(0.1770)、C(0.4024)以及G(0.1049)。

表3 ML和 BI分析所用核苷酸替代模型及參數(shù)

Tab.3 Models and parameters used in ML and BI analysis

注：利用hLRTs和AIC標(biāo)準(zhǔn)選擇的最佳模型都是GTR+I+G。其中G表示Gamma分布參數(shù)，I表示不變位點(diǎn)比例

Note：The best model of standard is GTR+I+G for hLRT and AIC.The G represents Gamma distribution shape parameter，I represents proportion of invariable sites

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

采用貝葉斯推論法(BI)對(duì)燕科和雨燕科13種鳥類重建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，燕科8種鳥類和雨燕科5種鳥類分別形成兩大單獨(dú)的支系，且節(jié)點(diǎn)后驗(yàn)概率達(dá)到了100%。其中，燕科鳥類分支中金腰燕(Cecropisdaurica)首先分化出來形成單獨(dú)的一個(gè)支系，隨后沙燕屬、燕屬和毛腳燕屬聚在一起形成一個(gè)大的分支。在雨燕科支系中，短嘴金絲燕最早分化出來形成單獨(dú)的分支，其余雨燕屬的5個(gè)種聚在一起形成一個(gè)大的支系(圖1)。

最大似然法(ML)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與貝葉斯推論法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。燕科8種鳥類和雨燕科5種鳥類分別形成兩大單獨(dú)的支系，其中，燕科鳥類分支中金腰燕首先分化出來形成單獨(dú)的一個(gè)支系，隨后沙燕屬、燕屬和毛腳燕屬7種鳥類聚在一起形成一個(gè)大的分支。在雨燕科支系中，短嘴金絲燕最早分化出來形成單獨(dú)的分支，其余雨燕屬的5個(gè)種聚在一起形成一個(gè)大的支系(圖2)。

2.3 遺傳距離

燕科和雨燕科13個(gè)物種兩兩之間的遺傳距離結(jié)果表明，白腰雨燕和洋斑燕(Hirundotahitica)之間遺傳距離最大，達(dá)到0.197，暗背雨燕(Apusacuticauda)和白腰雨燕之間的遺傳距離最小，為0.035。燕科內(nèi)部遺傳距離最大的為金腰燕和洋斑燕，兩者之間遺傳距離達(dá)到0.145，遺傳距離最小的是黑喉毛腳燕(Delichonnipalensis)和煙腹毛腳燕(D.dasypus)，為0.042。雨燕科內(nèi)部遺傳距離最大的為小白腰雨燕和短嘴金絲燕，其兩者之間的遺傳距離為0.096，遺傳距離最小的為白腰雨燕和暗背雨燕，兩者之間的遺傳距離為0.035。內(nèi)群與外群之間遺傳距離均較大，其范圍在0.169～0.208之間。

圖1 燕科和雨燕科部分鳥類系統(tǒng)發(fā)育樹(BI，Bayesian Inference)Fig.1 The phylogenetic tree of 13 species with Bayesianinference for Hirundinidae and Apodidae

圖2 燕科和雨燕科部分鳥類系統(tǒng)發(fā)育樹(ML，Maximum Likelihood)Fig.2 The phylogenetic tree of 13 species with MaximumLikelihood for Hirundinidae and Apodidae

表4 燕科、雨燕科部分鳥類之間遺傳距離

Tab.4 The genetic distance among species for Hirundinidae and Apodidae

3 討論

燕科和雨燕科13種鳥類Cytb基因分析結(jié)果顯示，4種堿基含量平均分別為：A(27.707%)、T(24.544%)、C(34.306%)以及G(13.443%)。堿基組成百分比顯示出堿基C的含量相對(duì)豐富，G的含量相對(duì)較低；所有序列嘧啶(C+T)的平均含量達(dá)58.850%，嘌呤(A+G)的平均含量為41.150%，嘧啶含量明顯高于嘌呤含量，表明堿基組成存在偏向性；且類似的堿基偏倚現(xiàn)象在雀形目鳥類中以及其他鳥類研究中也有發(fā)現(xiàn)[26-28]。本文通過對(duì)雀形目燕科和雨燕目雨燕科共13種鳥類基于線粒體基因Cytb進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的重建，結(jié)果表明燕科所有物種聚在一起形成單獨(dú)的一個(gè)分支，雨燕科所有物種聚在一起形成一個(gè)單獨(dú)的分支，其聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類相一致。

本文研究結(jié)果表明，燕科鳥類和雨燕科鳥類明顯分為兩個(gè)不同的支系，燕科8種鳥類單獨(dú)聚在一起，雨燕科5種鳥類聚在一起，且最大似然法和貝葉斯推理法所建系統(tǒng)發(fā)育樹具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。對(duì)燕科和雨燕科鳥類進(jìn)一步的遺傳距離分析表明，雨燕科和燕科之間遺傳距離較大，而各科內(nèi)部種間遺傳距離較小。因此，燕科鳥類和雨燕科鳥類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分別隸屬于雀形目和雨燕目。

一直以來，金絲燕的分類系統(tǒng)及其物種的分類一直存在著很大的爭(zhēng)議。一些研究者根據(jù)金絲燕的形態(tài)特征和窩特征來分類[29-30]，而另一些研究者是以金絲燕的回聲定位能力來作為分類的依據(jù)[31]。有研究者曾把所有的金絲燕歸依單一的屬名為Collocalia[32]。這個(gè)分類用了一百多年，一直到發(fā)現(xiàn)回聲定位能力的金絲燕。Brooke把金絲燕分為3個(gè)屬名為無回聲定位能力的Collocalia，無回聲定位能力的Hydrochous(包括巨瀑布雨燕Hydrochousgigas)和回聲定位能力的Aerodramus[33]。有關(guān)金絲燕屬內(nèi)種的劃分依然存在不同的觀點(diǎn)，因此還需通過進(jìn)一步的分子生物學(xué)手段，采用序列更長(zhǎng)以及更多的基因作為標(biāo)記來進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的重建，目前，雖然以線粒體DNA為標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和遺傳分析的研究已經(jīng)越來越普遍和成熟，然而，以多個(gè)線粒體基因標(biāo)記結(jié)合形成串聯(lián)序列以及線以粒基因和核基因標(biāo)記相結(jié)合，特別是隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，利用高通量測(cè)序技術(shù)(第二代測(cè)序技術(shù))測(cè)定物種全基因組已越來越普遍，這些新技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展對(duì)系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理的研究起到了很大的推動(dòng)作用，從而更加容易產(chǎn)生標(biāo)記基因更豐富、序列更長(zhǎng)以及更可靠的分析結(jié)果。因此，對(duì)燕科和雨燕科等鳥類的系統(tǒng)發(fā)育研究還應(yīng)該以多個(gè)標(biāo)記基因以及更長(zhǎng)的序列進(jìn)行分析，從而闡明金絲雀屬以及其他學(xué)界尚存在爭(zhēng)議的物種分類和歸屬問題。