黎嘉欣楊秋立普天春盧雁平王偉劉學(xué)鋒劉定震

(1.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部生物多樣性與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100875；2.圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京動(dòng)物園，北京，100044)

近年來，非損傷取樣法在野生動(dòng)物激素水平檢測(cè)上得到了充分的運(yùn)用，其中糞便樣品因其采集、保存和運(yùn)輸便利等優(yōu)勢(shì)而被廣泛使用[1]。正常情況下，糞便中性激素濃度與血液中性激素濃度正相關(guān)[2]。然而，由于激素在糞便中的代謝有滯后性，糞便與血液樣品的激素檢測(cè)結(jié)果會(huì)呈現(xiàn)分泌高峰時(shí)間不一致的現(xiàn)象[3]，加之對(duì)激素的不同抽提和檢測(cè)方法，往往導(dǎo)致最終檢測(cè)結(jié)果迥異。如何選擇合適的激素抽提方法和測(cè)定方法，是準(zhǔn)確反映動(dòng)物體內(nèi)類固醇激素水平的關(guān)鍵[4]。

非人靈長(zhǎng)類的繁殖行為及結(jié)果多由雌性的發(fā)情狀況決定，通過監(jiān)測(cè)雌性的性激素水平可以深入了解其繁殖策略。以往在恒河猴(Macacamulatta)[5]、日本獼猴(Macacafuscatafuscaca)[6]、夜猴(Aotustrivirgatus)[7]、黑葉猴(Trachypithecusfrancoisi)[8]、滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)[9]等多數(shù)非人靈長(zhǎng)類中均有較好的應(yīng)用。雌二醇(estradiol，E2)或孕酮(progesterone，P4)分泌水平的高低基本能反映雌性的繁殖狀態(tài)[10-12]。而王慧平等對(duì)川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)糞尿激素抽提方法比較的結(jié)果顯示，不同抽提方法的萃取率存在差異[11]?？紤]到不同物種，乃至同一類群的不同種群糞便中激素代謝物的種類均可能不同[4]，且不同激素性質(zhì)有所差異，所以針對(duì)不同種類的靈長(zhǎng)類和激素可能需要考慮不同的激素提取和檢測(cè)方法。

滇金絲猴隸屬于靈長(zhǎng)目(Primates)猴科(Cercopithecidae)疣猴亞科(Colobinae)仰鼻猴屬(Rhinopithecus)，是我國特有的珍稀靈長(zhǎng)類動(dòng)物。目前野生種群數(shù)量約為2500只，棲息地破碎化和喪失比較嚴(yán)重[13]。圈養(yǎng)種群總數(shù)為29只，主要飼養(yǎng)于北京動(dòng)物園、昆明動(dòng)物園和昆明動(dòng)物研究所。以往對(duì)滇金絲猴種群的地理分布、群體行為、食性等開展了一系列研究[14-15]，但受限于野外工作條件，對(duì)該物種的繁殖行為與激素水平的研究較少。借助針對(duì)圈養(yǎng)種群繁殖行為與激素水平關(guān)系的研究，不僅可為圈養(yǎng)滇金絲猴的遷地保護(hù)提供理論支持，同時(shí)為進(jìn)一步對(duì)野生種群的研究奠定基礎(chǔ)。為此，本文分別采用3種抽提方法與2種檢測(cè)方法，對(duì)圈養(yǎng)雌性滇金絲猴糞樣中E2及P4含量進(jìn)行了檢測(cè)，并比較了不同方法組合的激素相對(duì)含量、相對(duì)誤差和變異系數(shù)，以期探索適用于滇金絲猴糞便樣品激素檢測(cè)的合適方法，為進(jìn)一步研究野生滇金絲猴的繁殖生理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用21份糞便樣品分別采集于北京動(dòng)物園昌平十三陵飼養(yǎng)繁育基地的一雄二雌繁殖群中的2只成年雌性滇金絲猴——“芳芳”與“大慶”，以及北京動(dòng)物園的成年雌性“01-2”，共計(jì)3只個(gè)體。其中“大慶”的糞便7份、“芳芳”的糞便6份、“01-2”的糞便8份。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糞便樣品的采集、保存與干燥

實(shí)驗(yàn)人員站在籠舍周圍，觀察目標(biāo)個(gè)體，一旦發(fā)現(xiàn)其排便后，將糞便除去雜物后立即裝于自封袋，標(biāo)記日期、時(shí)間和個(gè)體名稱，保存于-20℃冰箱，待測(cè)。將收集的21份糞便樣品放于-70℃冰箱冷凍過夜，記錄糞便重量41.13 g。-55℃真空冷凍干燥機(jī)中干燥約9 h，記錄凍干糞便重量13.72 g(含水量為66.64%)，將糞便樣品研磨成粉末狀并篩除雜質(zhì)。所有糞便樣品放入同一離心管中，置于渦旋儀上振蕩至混合均勻，以排除不同個(gè)體、不同采集時(shí)間等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果可能造成的影響。

1.2.2 激素提取

根據(jù)王慧平等[11]對(duì)于川金絲猴的糞便類固醇激素抽提方法的評(píng)估，并參考其他非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物糞便激素提取中常用抽提方法和改良途徑，采用以下3種抽提方法進(jìn)行激素的提取。

乙醇加熱法(ethanol-heating method，EH)：參照Wasser等[10]的步驟，應(yīng)用80%乙醇對(duì)0.1 g混合糞樣進(jìn)行抽提，其中煮沸改為70℃水浴20 min，離心條件由室溫改為4℃，并合并2次上清液，將其置于60℃條件下氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL 0.05 mol/L的PBS溶解，離心后將上清轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管待測(cè)。

乙醇-蒸餾水法(ethanol-distilled-water method，EW)：參照高云芳等[16]的步驟，首先應(yīng)用5 mL 80%乙醇對(duì)0.1 g混合糞樣進(jìn)行抽提，其中超聲波振蕩改為渦旋振蕩，并將37℃水浴干燥步驟改為37℃氮?dú)獯祾邇x干燥。在加入1 mL 0.05 mol/L的PBS溶解后，37℃水浴振蕩30 min，離心后將上清轉(zhuǎn)移至2 mL離心管待測(cè)。

乙醇-丙酮法(ethanol-acetone method，EA)：參照Heistermann等[17]的步驟，首先應(yīng)用4 mL無水乙醇和1 mL無水丙酮對(duì)0.1 g混合糞樣進(jìn)行抽提，離心條件由室溫改為4℃，60℃條件下氮?dú)獯祾?，之后加?.05 mol/L的PBS溶液復(fù)溶，離心后將上清轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管待測(cè)。

分別以上述3種方法對(duì)糞樣中的雌二醇和孕酮進(jìn)行抽提，各重復(fù)6次。同時(shí)對(duì)每種抽提方法各設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組，即不加入糞樣，完成全部抽提步驟并保存所得溶液，與上述樣品進(jìn)行同一批次的激素檢測(cè)，以排除抽提步驟所用試劑對(duì)檢測(cè)試劑盒中抗體與激素的反應(yīng)可能造成的影響。

1.2.3 糞便激素水平檢測(cè)

將上述激素抽提樣品，每份各取500 μL于2 mL離心管中留作P4的RIA法和ELISA法檢測(cè)。對(duì)于乙醇加熱法以及乙醇蒸餾水法，將樣品分別稀釋48倍和64倍留作E2的ELISA法的檢測(cè)，均稀釋80倍的樣品留作E2的RIA法的檢測(cè)；對(duì)于乙醇丙酮法，將樣品稀釋8倍留作E2的檢測(cè)，確保其檢測(cè)結(jié)果處于相應(yīng)試劑盒的允許檢測(cè)范圍之內(nèi)，將稀釋后的樣品存于-20℃冰箱。激素檢測(cè)委托北京北方生物研究所完成。每份樣品平行測(cè)試3次。所用檢測(cè)試劑盒分別為碘[125I]雌二醇和碘[125I]孕酮放射免疫分析試劑盒、雌二醇和孕酮定量測(cè)定酶聯(lián)免疫試劑盒(北方生物研究所，北京)。有關(guān)試劑盒的詳細(xì)參數(shù)詳見說明書。

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先，采用Kolmogorov-Smironov test檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，然后以檢測(cè)方法作為組間因子，抽提方法作為組內(nèi)連續(xù)檢測(cè)變量對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析(repeated measure two-way ANOVA)，隨后，對(duì)具有顯著差異的組合分別進(jìn)行配對(duì)t-檢驗(yàn)(paired-samplettest)，分析抽提方法與檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

由于2個(gè)檢測(cè)方法對(duì)同一類固醇性激素的靈敏程度和每個(gè)抽提方法對(duì)空白對(duì)照組的反應(yīng)程度不同，不能直接對(duì)2種方法空白對(duì)照組的平均檢測(cè)含量進(jìn)行比較，所以使用相對(duì)誤差描述空白對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果對(duì)抽提及檢測(cè)方法組合檢測(cè)結(jié)果的影響。其計(jì)算公式為：相對(duì)誤差=空白對(duì)照組平均檢測(cè)含量/實(shí)驗(yàn)組平均檢測(cè)含量×100%。結(jié)合平均激素含量與相對(duì)誤差，比較得出提取效率較高且受空白對(duì)照影響較小的抽提與檢測(cè)方法組合。

根據(jù)公式CV%=(SD/Mean)×100%計(jì)算每個(gè)組合的變異系數(shù)，對(duì)比獲得穩(wěn)定性較高的抽提及檢測(cè)方法組合。

所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)通過SPSS 20.0(IBM Corporation，NY，USA)完成。借助OriginPro 8.0繪圖。顯著水平為0.05，P<0.01為差異極顯著。數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抽提方法與檢測(cè)方法對(duì)糞便中類固醇性激素檢測(cè)結(jié)果影響的比較

以抽提方法為組內(nèi)因子，以檢測(cè)方法為組間因子對(duì)糞便中孕酮含量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行two-way ANOVA分析，結(jié)果表明，使用不同抽提方法與不同檢測(cè)方法檢測(cè)，結(jié)果均有極顯著差異(P均為0.0001)，且抽提方法與檢測(cè)方法之間有交互作用。進(jìn)一步多重比較分析結(jié)果表明，對(duì)于RIA與ELISA兩種檢測(cè)方法，乙醇加熱法與乙醇-蒸餾水法之間均沒有顯著差異，而乙醇-丙酮法的檢測(cè)結(jié)果顯著低于另外兩種抽提方法的檢測(cè)結(jié)果(圖1)。

以抽提方法為組內(nèi)因子，以檢測(cè)方法為組間因子對(duì)糞便中雌二醇含量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行repeat measure two-way ANOVA分析，結(jié)果表明，RIA與ELISA兩種檢測(cè)方法對(duì)測(cè)定結(jié)果有極顯著影響(P=0.0001)；乙醇加熱法與乙醇蒸餾水法2種抽提方法的測(cè)定結(jié)果間無明顯差異(P=0.584)；抽提方法與檢測(cè)方法之間無交互作用(圖2)。對(duì)于乙醇加熱法，RIA結(jié)果顯著低于ELISA的檢測(cè)結(jié)果；而對(duì)乙醇-蒸餾水法，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果無明顯差異(圖2)。

2.2 比較不同抽提及檢測(cè)方法的組合間糞便類固醇激素的平均激素含量、相對(duì)誤差及變異系數(shù)的差異

對(duì)混合糞樣中的孕酮而言，乙醇-丙酮法的激素含量測(cè)定結(jié)果明顯偏低，乙醇加熱法與乙醇-蒸餾水法無明顯差異；對(duì)于混合糞樣中的雌二醇而言，乙醇-蒸餾水法的激素含量測(cè)定結(jié)果較高，提取效率較高(表1)。

圖1 不同抽提方法與檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的糞便中孕酮的檢測(cè)結(jié)果(柱圖表示Mean±SD)。本研究對(duì)數(shù)據(jù)使用two-way ANOVA進(jìn)行分析，并對(duì)具有顯著差異的組合進(jìn)行了paired-sample t test，對(duì)有顯著差異的數(shù)據(jù)使用不同上標(biāo)或是橫線連接后以星號(hào)標(biāo)注Fig.1 Mean content of progesterone(P4)in mixed fecal sample under different extraction and test methods.Bars with different letters，either capital or small letters in the same assay method，indicate significant differences(repeated measure two-way ANOVA followed by post hoc test of paired-sample t test)

圖2 不同抽提方法與檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的糞便中雌二醇的檢測(cè)結(jié)果(柱圖表示Mean±SD)。本研究對(duì)數(shù)據(jù)使用two-way ANOVA進(jìn)行分析，并對(duì)具有顯著差異的組合進(jìn)行了paired-sample t test，對(duì)有顯著差異的數(shù)據(jù)使用不同上標(biāo)或是橫線連接后以星號(hào)標(biāo)注Fig.2 Mean content of estradiol(E2)in mixed fecal sample under different extraction and test methods.Bars with different letters，either capital or small letters in the same assay method，indicate significant differences(repeated measure two-way ANOVA followed by post hoc test of paired-sample t test)

表1 不同抽提與檢測(cè)方法的混合糞樣激素含量測(cè)定結(jié)果(Mean±SD)

Tab.1 Fecal concentrations of progesterone and estradiol using different extracting and testing methods

相對(duì)誤差的大小能夠在一定程度上表明測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，相對(duì)誤差小則檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度高。對(duì)于孕酮而言檢測(cè)準(zhǔn)確度較高的組合有二：RIA與乙醇加熱法的組合以及ELISA與乙醇-丙酮法的組合；對(duì)于雌二醇而言檢測(cè)準(zhǔn)確度有明顯優(yōu)勢(shì)的是RIA，其中乙醇加熱法的空白對(duì)照組未檢測(cè)出激素含量(表2)。

表2 不同抽提與檢測(cè)方法的空白對(duì)照激素含量測(cè)定結(jié)果(Mean±SD)及混合糞樣的相對(duì)誤差

Tab.2 Fecal concentrations of progesterone and estradiol in negative control(Mean±SD)and relative errors using different extracting and testing methods

注：相對(duì)誤差=空白對(duì)照組平均檢測(cè)含量/實(shí)驗(yàn)組平均檢測(cè)含量×100%

Note：Relative error=content of negative control/content of fecal sample×100%

變異系數(shù)的大小能夠表征檢測(cè)的穩(wěn)定性，變異系數(shù)小則方法組合的穩(wěn)定性高。孕酮檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)較小的組合為RIA與乙醇加熱法；對(duì)于雌二醇而言，乙醇加熱法的變異系數(shù)明顯小于乙醇-蒸餾水法，其中與RIA的組合變異系數(shù)最小(表3)。

表3 不同抽提方法與檢測(cè)方法組合檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)

Tab.3 Coefficient variation of fecal progesterone and estradiol level using different extracting and testing methods

注：變異系數(shù)CV%=(SD/Mean)×100%

Note：CV%=(SD/Mean)×100%

3 討論

本研究結(jié)果表明，不同的激素抽提和檢測(cè)方法對(duì)滇金絲猴糞便中孕酮和雌二醇的檢測(cè)結(jié)果都有顯著影響。對(duì)于孕酮，乙醇-丙酮法提取效率明顯偏低，乙醇加熱法與乙醇-蒸餾水法在提取效率上無明顯差異，但乙醇加熱法與RIA法組合檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較高；同時(shí)乙醇加熱法與RIA的組合變異系數(shù)明顯較小，穩(wěn)定性較高，因此可認(rèn)為乙醇加熱法與RIA的組合有較明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究中乙醇丙酮法提取效率偏低的結(jié)果，與以往針對(duì)黃狒狒(Papiocynocephalus)、絹毛猴(Callithrixjacchus)、鞍背狨(Saguinusfuscicollis)、棉頂狨(Saguinusoedipus)和川金絲猴雌性個(gè)體糞樣中孕酮回收率較高(>80%)的結(jié)果[11，17-18]不同。這表明種屬差異可能是影響不同抽提及檢測(cè)方法組合的抽提率和穩(wěn)定性的因素之一。對(duì)于雌二醇，乙醇-蒸餾水法提取效率較高，但乙醇-蒸餾水法穩(wěn)定性明顯偏低且步驟繁瑣，不利于針對(duì)野外大批量的糞樣處理操作。乙醇加熱法中，RIA與ELISA兩個(gè)檢測(cè)方法的穩(wěn)定性表現(xiàn)差異不大，但由于ELISA測(cè)定的雌二醇含量相對(duì)誤差較大，綜合考慮認(rèn)為乙醇加熱法與RIA的組合較有優(yōu)勢(shì)。

乙醇加熱法與RIA的組合對(duì)于雌二醇與孕酮均為較理想的抽提檢測(cè)方法組合。乙醇加熱法是經(jīng)典、簡(jiǎn)便的激素抽提方法，在多個(gè)物種的糞樣激素抽提中均有較理想的應(yīng)用[10-11，19-20]。3種抽提方法在抽提激素的過程中均涉及干燥步驟，常用方法有恒溫水浴和氮?dú)獯祾?。由于水浴蒸干耗時(shí)極長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)將干燥條件統(tǒng)一改為氮?dú)獯蹈?，并保留原方法中要求的水浴溫度，以加快抽提速度，但相?yīng)的抽提成本有所增加。RIA是最早用于激素檢測(cè)的免疫檢測(cè)法，在1969年已有人用于檢測(cè)血清中E2的含量。該法靈敏度較ELISA高且結(jié)果穩(wěn)定，但要求必須在具備資質(zhì)的同位素實(shí)驗(yàn)室操作，具有對(duì)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)條件要求高、試劑存放周期短等缺點(diǎn)。若實(shí)驗(yàn)室條件允許，建議選用RIA進(jìn)行激素水平檢測(cè)。

綜上所述，建議在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，采取氮?dú)獯蹈煞ǜ牧嫉囊掖技訜岱ㄌ崛〖に兀訰IA法檢測(cè)滇金絲猴糞便中雌二醇與孕酮含量。同時(shí)，建議以類固醇激素水平監(jiān)測(cè)其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物的繁殖行為時(shí)，最好綜合本文提及的3種參數(shù)比較方法，首先對(duì)激素抽提法進(jìn)行篩選，然后再進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。

致謝：感謝北京動(dòng)物園的飼養(yǎng)員幫助采集金絲猴糞便樣品，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王慧平提供參考文獻(xiàn)，北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院佟麗借用冷凍干燥機(jī)、碩士研究生唐如春、博士研究生劉若爽與范鵬來等提供技術(shù)指導(dǎo)，謹(jǐn)此表示誠摯的謝意！