田飛焱 歐陽敏 謝世紅 王龍 徐節(jié)華 劉文珍 花麒 孟霞 銀旭紅 劉彬

(1. 江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江西南昌 330046；2. 彭澤縣水產(chǎn)局，江西九江，332700)

0 引言

鯽魚作為江西省食用魚的主要品種之一，2016年江西省鯽魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達21.21萬噸，產(chǎn)量穩(wěn)步持續(xù)增長。目前，江西省養(yǎng)殖的優(yōu)良品種鯽魚包括：彭澤鯽魚、萍鄉(xiāng)肉紅鯽魚、異育銀鯽魚等，它們不僅有良好的食用價值，有些還有很好的觀賞價值。然而，近年來，在江蘇等省一種新的嚴重危害養(yǎng)殖鯽魚的鰓出血性疾病開始悄然發(fā)生與傳播，該病的致死率最高可達90%～100%，給這些省造成了嚴重的漁業(yè)經(jīng)濟損失，后經(jīng)證實該鰓出血性疾病的病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型[(cyprinid herpesvirus 2， CyHV-2[1-3]，疾病名稱確定為鯽魚造血器官壞死病，也有稱為金魚造血器官壞死病(Goldfish Haematopoietic necrosis， GFHN)]、異育銀鯽“鰓出血病”或金魚皰疹病毒性造血器官壞死病。該病主要發(fā)生在春秋季節(jié)，受水溫影響較大，15℃～25℃易發(fā)病，水溫高于25℃發(fā)病率下降[4，5]。目前，CyHV-2在內(nèi)陸池塘養(yǎng)殖的鯽中有呈明顯的蔓延趨勢，因此調(diào)查江西省養(yǎng)殖區(qū)域是否存在CyHV-2分布顯得尤為緊迫。為了調(diào)查了解CyHV-2在江西省鯽魚養(yǎng)殖區(qū)域的傳入與分布情況，保障江西省鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，本研究于2015～2017年應用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction， PCR)和實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR， qPCR)方法對全省范圍內(nèi)一些重要苗種場和養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖鯽魚進行CyHV-2監(jiān)測，并比較了不同地區(qū)CyHV-2分離株的分子特征，旨在摸清本地區(qū)鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)流行本底情況，提高疫病風險預警防控能力，避免發(fā)生區(qū)域性重大疫情。

1 材料與方法

1.1 采樣

鯽魚樣品：2015～2017年組織全省縣級水生動物防疫站在全省范圍內(nèi)抽檢水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場，每個水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場每年只抽檢一個批次樣品，三年共抽檢80批體表檢查均無明顯病癥的樣品[根據(jù)某一魚類養(yǎng)殖群體(≥100000尾)假定病原2%感染率，確定每批采集樣品數(shù)≥150尾]，并依據(jù)流行病學情況填寫現(xiàn)場采樣記錄，由省水產(chǎn)技術(shù)推廣站水生動物疫病監(jiān)控中心進行鯽魚造血器官壞死病原檢測；部分臨床疑似病例在鯽魚造血器官壞死病發(fā)病高峰期間由省內(nèi)漁民送檢，由省水產(chǎn)技術(shù)推廣站水生動物疫病監(jiān)控中心進行病原檢測。

1.2 樣品處理

取鯽魚體內(nèi)臟(一般為腎、脾、肝)或鰓置于研磨器中，加入10倍體積的無菌PBS研磨，反復凍融2～3次，待勻漿后將全部勻漿液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中，10000離心2分，取100μL上清液于1.5mL EP管中。

1.3 DNA抽提

取已處理的樣品100μL，按照天根生物科技有限公司的血液/組織/細胞基因組提取試劑盒(DP304)試劑盒或Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit說明書的方法提取總DNA，作為PCR擴增模板。

1.4 PCR檢測

使用TaKaRa PCR Amplification Kit進行PCR檢測，采用兩對特異引物(如表1所示)分別擴增 CyHV-2 的DNA聚合酶基因和解旋酶基因中的片段。反應體系為：10×PCR Buffer(Mg2+) 5μl，dNTPs (含dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各10 mmoL/L) 1μl，引物CyHVpol-F(或CyHV2Hel-F)(10μM) 1μl，引物CyHVpol-R(或CyHV2Hel-R)(10μM) 1μl，DNA 模板2.5μl，Taq酶(5U/μL，TaKaRa) 0.5μl，純水補足至50μl。反應程序為：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃(CyHV引物)或60℃(CyHV-2引物)1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸 10min，最后4℃保溫。

表1 CyHV-2 普通PCR 2對引物序列

1.5 熒光PCR復檢

對普通PCR擴增條帶不明顯的監(jiān)測或病例樣品采用熒光PCR進行進一步的擴增檢測(如表2所示)。在PCR管中依次加入：2×預混合液(2×supermix)6.25μL、正向和反向引物各0.5μL、探針0.5μL、模板2.5μL、加水定容至12.5μL。瞬時離心，將反應管置于熒光PCR儀。反應程序為：95℃ 2分；95℃ 30秒、58℃ 45秒、72℃ 45秒，共40個循環(huán)；在每次循環(huán)72℃退火延伸時收集熒光，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

表2 CyHV-2 熒光PCR引物和探針序列

1.6 序列分析

所有PCR電泳呈陽性的樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測序后用DNAStar以及NCBI BLAST對測序結(jié)果進行核苷酸序列同源性分析，從GenBank中選取與陽性序列相似的參考毒株，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測

利用CyHV/CyHV-2引物進行PCR擴增后，陽性對照會出現(xiàn)362 bp/366 bp的特異性條帶，陰性對照和空白對照均沒有該條帶，待測樣品擴增出362 bp/366 bp的條帶，初步判定待測樣品pol/Hel PCR陽性，未擴增出目的條帶得判定為pol/Hel PCR陰性。同時滿足以上兩條的可判定為CyHV-2陽性(如圖1所示)。

圖1 CyHV-2 PCR擴增電泳圖

2.2 熒光PCR檢測

對PCR擴增條帶不明顯的監(jiān)測樣品，采用熒光PCR進行進一步的擴增檢測，Ct值≤35且出現(xiàn)典型擴增曲線，判定為熒光PCR陽性(如圖2所示)；對于35

圖2 CyHV-2熒光PCR擴增圖譜

2.3 監(jiān)測結(jié)果

如表3所示，2015～2017年在江西9個地級市的22個區(qū)(縣、市)的水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場采集并檢測樣品80批次，監(jiān)測品種包括鯽和金魚，共監(jiān)測到CyHV-2陽性樣品6個批次，總的陽性檢出率為 7.5%。陽性樣品來源的地級市包括江西省鯽主養(yǎng)區(qū)南昌市、鷹潭市、吉安市和觀賞紅鯽養(yǎng)殖區(qū)萍鄉(xiāng)市。陽性樣品分布區(qū)域較為分散，贛東、贛中、贛西、贛南均有陽性檢出，在地理上是分散的，并不連接成片，相互間沒有水源相通。

表3 2015～2017年江西地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場CyHV-2監(jiān)測情況

2.4 流行特征

時間分布：2015～2017年在江西地區(qū)春季檢測樣品32個，陽性5個，陽性檢出率15.6%；秋季檢測樣品48個，陽性1個，陽性檢出率0.02%。統(tǒng)計分析與2檢驗表明春、秋兩季的CyHV-2的陽性檢出率沒有差別(P>0.1)，即季節(jié)對CyHV-2的陽性檢出率無顯著性影響。

遺傳進化樹和同源性分析：所有PCR電泳呈陽性的樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測序后與GenBank中的參考序列進行NCBI BLAST同源性比對，相似度均在99%以上，確定為CyHV-2陽性?；?015～2017年CyHV-2監(jiān)測數(shù)據(jù)，進行CyHV-2 DNA解旋酶基因部分序列同源性的系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示江西省監(jiān)測的所有CyHV-2毒株與YC110907、SY-C1、JS2012、H.Fukuda等CyHV-2病毒株屬同一分支，與KHV-I、KHV-U等CyHV-3病毒株的親緣關(guān)系較近，而與CyHV-1的親緣關(guān)系相對較遠(如圖3所示)。

圖3 基于CyHV-2 DNA解旋酶基因部分序列同源性的系統(tǒng)進化分析

3 討論

20世紀90年代，在日本西部養(yǎng)殖的金魚發(fā)生皰疹病毒性造血器官壞死病大流行，死亡率幾乎達到了100%，這是有關(guān)該病的首次報道[4]。隨后，美國養(yǎng)殖的金魚幼魚也發(fā)生此病，并存在著廣泛的病原分布，造成的死亡率通常高達80%以上[5，6]。觀賞魚的國際貿(mào)易很大程度上促進了該病的迅速傳播[7]，在這之后其他國家或地區(qū)相繼有該疾病暴發(fā)的報道[8-11]，2011年在匈牙利養(yǎng)殖的銀鯽也發(fā)現(xiàn)了CyHV-2感染的病例[12]，在我國鯽造血器官壞死病在2012年之前還未見有爆發(fā)流行的文獻報道[13]，2013年李莉娟等針對國內(nèi)市場上流通的金魚開展CyHV-2的流行病學調(diào)查，表明不同區(qū)域的金魚攜帶CyHV-2的帶毒率為13.89%，表明我國已有CyHV-2的分布[14]。最近幾年隨著該病原的傳入給我國一些地區(qū)的鯽養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟損失。

已有研究表明，CyHV-2存在垂直傳播的特性[15]，潛伏感染也是皰疹病毒的主要特征之一[16]，因此，一旦親魚攜帶病毒，就能通過魚卵傳播給子代，導致病原進一步擴大傳播，苗種是漁業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，健康優(yōu)質(zhì)的苗種需要從源頭上切斷疾病的傳播。鑒于全國范圍內(nèi)苗種和觀賞魚的流通使該病原傳入我省的風險極大，必須通過病原監(jiān)測來掌握該病病原傳入與分布情況來提高我省疫病風險預警防控能力，避免發(fā)生區(qū)域性重大疫情。目前，江西省養(yǎng)殖的良種鯽包括：彭澤鯽、萍鄉(xiāng)肉紅鯽、異育銀鯽、湘云鯽等品種，其中彭澤鯽是江西省選育出的優(yōu)良品種，是“鄱陽湖”注冊商標的重要養(yǎng)殖對象，并已逐步形成了我省的彭澤鯽產(chǎn)業(yè)集群；萍鄉(xiāng)肉紅鯽更是當?shù)氐陌倌晏禺a(chǎn)，不僅有良好的食用價值，而且還很有觀賞價值。連續(xù)三年(2015～2017年)監(jiān)測的數(shù)據(jù)顯示，80批次樣品檢出的6例陽性樣本，累積平均陽性檢出率為7.5%，6批陽性樣品分別來自3家省級原良種場和3家成魚養(yǎng)殖場，省級原良種場陽性樣本占總陽性樣本的50%，說明我省鯽養(yǎng)殖業(yè)和觀賞金魚養(yǎng)殖業(yè)存在感染CyHV-2的風險，也無疑會給鯽造血器官壞死病在江西省進一步擴大流行范圍埋下了隱患。在監(jiān)測所覆蓋的9個各地級市中，有4個地級市檢出了陽性樣本，包括江西省鯽主養(yǎng)區(qū)南昌市、鷹潭市、吉安市和觀賞紅鯽養(yǎng)殖區(qū)萍鄉(xiāng)市。陽性樣本分布區(qū)域較為分散，贛東、贛中、贛西、贛南均有陽性檢出，說明在江西省鯽造血器官壞死病存在擴大流行區(qū)域的特征。鑒于當前鯽造血器官壞死病病原陽性檢出率和分布尚未成擴散的趨勢，因此需要在鯽苗種的主要產(chǎn)區(qū)應進行苗種檢驗檢疫，杜絕從陽性養(yǎng)殖場輸出攜帶病毒的苗種，從源頭上切斷病毒的擴散途徑，防控CyHV-2的傳播，筑牢產(chǎn)業(yè)生物安全屏障。