葛云飛 康子悅 沈 蒙 王維浩,2 曹龍奎,2

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319) (黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319)

高粱作為我國第五大糧食作物，因其高產性和高抗逆性及其在制糖、釀酒和飼料等產業(yè)方面用途廣泛而被大量種植[1]。但由于高粱的適口性較差口感較粗糙不易被消費者所接受，因此主要將其應用于飼料行業(yè)中，使高粱價值并沒有得到充分利用。自然發(fā)酵谷物是我國生產食品的特殊方法，因其改善口感、增加風味、提高營養(yǎng)成分而被大眾廣泛認同，目前我國發(fā)酵領域主要集中在發(fā)酵小米[2]、發(fā)酵玉米[3]、發(fā)酵大米[4]、發(fā)酵黃米[5]。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵處理可提高谷物的抗老化性能、改善產品的流變性并使淀粉凝膠硬度下降。目前學者研究發(fā)酵高粱主要集中在高粱的產品研發(fā)、菌種鑒定及其分離純化[6]，但對自然發(fā)酵對高粱理化性質的影響研究較少。淀粉為高粱中主要的碳水化合物，質量分數(shù)約為60%～70%，高者可達80%左右，因此淀粉的性質決定了高粱產品的加工性能和食用品質，其中淀粉的糊化、老化性質對其產品的研究開發(fā)有較大影響[7]。為開闊高粱淀粉的應用領域，本實驗將以高粱為發(fā)酵對象，對其進行自然發(fā)酵0～15 d，觀察不同發(fā)酵時期高粱淀粉理化性質的變化，以實現(xiàn)高粱發(fā)酵的工業(yè)化生產，為高粱淀粉的應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高粱，山東臨沂R高粱；鹽酸(分析純)、氧化鈉(分析純)、碘及碘化鉀蒸餾水、無水乙醇、乙酸：天津市大茂化學試劑廠；葡聚糖標準品、直鏈淀粉標準品、支鏈淀粉標準品：Sigma公司。

1.2 儀器與設備

RVA4500型快速黏度分析儀：瑞典波通儀器公司；DSC1型差示掃描量熱儀：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；TAQ2000國產高壓不銹鋼坩堝：上海瑾恒儀器有限公司；T6型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；HJ25-SCT-02型索氏提取器：上海森信實驗儀器有限公司；BUCHI-K370型全自動凱氏定氮儀：瑞士BUCHI公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 自然發(fā)酵高粱

取高粱150 g，經蒸餾水水洗3次，加入一定量的蒸餾水(料液比1∶2 g/mL)、3%葡萄糖，在30 ℃條件下進行自然發(fā)酵0～15 d。

1.3.2 自然發(fā)酵高粱粉化學成分含量的測定

1.3.2.1 粗脂肪含量的測定

精確稱取自然發(fā)酵0～15 d的高粱粉2 g，裝入濾紙筒,然后放入抽提器內。把抽提器與已知恒重的干燥抽提瓶聯(lián)接于冷凝器上，由冷凝器上口加入石油醚50 mL，接通冷凝水，將水浴鍋的溫度調到65 ℃左右開始蒸餾，控制虹吸次數(shù)為20次/h左右。蒸餾6 h后，取出濾紙筒，回收石油醚，抽提瓶于105 ℃干燥箱中烘干l h后稱重。

1.3.2.2 粗蛋白含量的測定

精確稱取自然發(fā)酵0～15 d的高粱粉1 g，方法為凱氏定氮法，具體參照GB 5009.5—2010[8]中的蛋白質的測定方法。

1.3.2.3 灰分的測定

精確稱取自然發(fā)酵0～15 d的高粱粉2 g于已知恒重的坩鍋內，將蓋稍錯開約0.5 cm，置于電爐上灼燒完全碳化至無煙為止，再置于馬福爐中，在550 ℃灼燒2～3 h至試樣變成白色或灰白色，取出于干燥器內冷卻稱重。然后再復灼燒0.5 h，取出冷卻稱重，直至前后兩次質量差不超過0.2 mg為恒重。如果最后一次質量增大，則以前一次質量計算，精確至0.000 1 g，結果計算到小數(shù)點后第二位，雙實驗許可誤差不超過0.03%，取平均值。

1.3.3 自然發(fā)酵高粱淀粉的制備

發(fā)酵后的高粱進行水洗，于35 ℃下烘干。將干磨后過80目篩的高粱粉于1/3 g/mL，質量濃度為0.3 g/100 mL的NaOH溶液中浸提3 h，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，除去沉淀中上層黃褐色物質，連續(xù)水洗四次、離心直至淀粉漿呈白色為止。用1 mol/LHCl調淀粉漿至pH為7.0，4 000 r/min離心10 min、30℃干燥，過80目篩備用[9]。

1.3.4 發(fā)酵高粱淀粉保水力和溶解度的測定

準確稱取0.5 g樣品于50 mL試管中，配成質量分數(shù)為2%的淀粉乳，分別在40 ℃和80 ℃下混勻并加熱30 min，快速冷卻，然后在4 000 r/min的轉速下離心15 min分離上清液和沉淀物，測定沉淀質量和上清液干物質質量(105 ℃烘至恒重)。溶解度為上清液干物質質量與樣品干基質量百分比，保水力為沉淀質量同樣品干基質量減去上清液干物質質量的百分比。

1.3.5 發(fā)酵高粱淀粉透明度的測定

確稱樣品1.000 g，配制質量濃度為1 g/100 mL的淀粉乳，置于沸水浴中糊化30 min后，冷卻至室溫，在620 nm波長處測定其透明度。以蒸餾水為空白對照。

1.3.6 發(fā)酵高粱直鏈淀粉含量的測定

1.3.6.1 直鏈淀粉標準曲線的繪制

分別稱取0.1 g直鏈淀粉、支鏈淀粉標準品于燒杯中，分別加入無水乙醇1 mL，1.0 moL/L NaOH9 mL，搖勻于沸水浴中加熱10 min，冷卻后定容至100 mL容量瓶中，即得1 mg/mL的直鏈/支鏈淀粉標準液。取5個100 mL的容量瓶分別加入上述直鏈淀粉標準液0、0.25、0.5、1、1.5 mL，再依次加入支鏈淀粉標準品5、4.75、4.5、4、3.5 mL，另空白樣為0.09 moL/LNaOH 5 mL，依次加入1 mL乙酸溶液(1 moL/mL)和1 mL碘試劑(2%碘化鉀和0.2%碘)用水定容至25 mL，顯色10 min，于620 nm處比色并記錄吸光度值。以直鏈淀粉質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作直鏈淀粉標準曲線。

1.3.6.2 發(fā)酵樣品直鏈淀粉含量的測定

稱取發(fā)酵后的淀粉樣品0.1 g于燒杯中，方法同上，冷卻后定容至100 mL容量瓶中。依次加入乙酸溶液和碘試劑各1 mL用水定容至50 mL，顯色10 min，于620nm處比色并記錄吸光度值。

1.3.7 發(fā)酵高粱淀粉老化性質的測定

稱取3.50 0 g(干基)發(fā)酵及未發(fā)酵高粱淀粉于鋁筒中，加蒸餾水25 mL，35 ℃保溫3 min，設定轉速率6 ℃/min加熱到95 ℃，保溫5 min，以6 ℃/min的轉速率降溫到50 ℃，用儀器配套的軟件分析得到曲線[10]。

1.3.8 發(fā)酵高粱淀粉糊化特性的測定

稱取3.0 mg(干基)發(fā)酵及未發(fā)酵高粱淀粉于坩堝中，加入7 μL蒸餾水，用壓片器反復壓3～4次至坩堝邊緣密封完好。室溫下均衡12 h，在N2流量為150 mL/min、壓力0.1 MPa、速度升溫5 ℃/min[11]的條件下測定不同樣品的糊化特性曲線。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel、Spss軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Origin軟件進行繪圖處理，各數(shù)據(jù)重復測定3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 自然發(fā)酵高粱粉化學成分含量的測定

隨著發(fā)酵時間的延長，高粱粉的粗脂肪、蛋白及灰分均呈下降的趨勢(圖1)：其原因是自然發(fā)酵產生的有機酸和酶類物質使與淀粉結合的蛋白質、油脂發(fā)生降解，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白質被降解成小分子的肽或者氨基酸更易溶出；而脂肪降解為游離脂肪酸，游離脂肪酸會進一步降解為小分子的醛、酮物質，因此伴隨著發(fā)酵的進行，會有不良氣味生成；由于油脂和蛋白質的降解，使原來與蛋白質、脂肪和淀粉結合形成的結合物中所包埋的礦物質更易釋放出來，從而使發(fā)酵后大米粉的灰分含量降低。

圖1 自然發(fā)酵對高粱粉化學成分含量的影響

2.2 自然發(fā)酵對高粱淀粉保水力和溶解度的影響

不同發(fā)酵時間下的高粱淀粉的保水力與溶解度變化趨勢如圖2所示：在80 ℃時發(fā)酵高粱淀粉的保水力及溶解度均較高于40 ℃。在較高溫度下，淀粉的保水力較高，其原因是在一定的糊化溫度下，淀粉的結晶結構被破壞，淀粉吸水能力增強，保水力增加，淀粉的膨脹力較大，因此DSC(差示掃描量熱儀)的糊化溫度較低、糊化速度較快[12]。在發(fā)酵前期淀粉的保水力及溶解度因發(fā)酵底物有機酸、酶等對直鏈淀粉的降解作用而有小幅度的降低，但隨著發(fā)酵時間的延長支鏈淀粉被水解成小分子的糖及短直鏈淀粉，使直鏈淀粉的比例相對增加，保水力、溶解度也隨之增加[13]，在發(fā)酵后期淀粉被充分降解成為小分子的糖，所以保水力及溶解度均呈降低趨勢。

圖2 自然發(fā)酵對淀粉保水力和溶解度的影響

2.3 自然發(fā)酵對高粱淀粉透明度的影響

透明度與淀粉顆粒結構的緊密程度及糊化特性有一定的關聯(lián)，其大小直接影響到淀粉基產品的外觀及用途，糊化后的淀粉分子重新聚合排列程度對淀粉的透明度影響較大[14]，不同發(fā)酵時間對高粱淀粉透明度的影響結果如圖3所示。隨著發(fā)酵時間的延長，淀粉的透明度有降低隨后稍有增加，在一定發(fā)酵時間下，淀粉糊化使其顆粒結構的締合程度減弱，直鏈淀粉分子從顆粒中析出，增加了淀粉分子的重排及相互締合的機會，使高粱淀粉的透明度下降，由于發(fā)酵使淀粉中的支鏈淀粉的長鏈部分發(fā)生裂解或者脫支，直鏈淀粉的比例相對增加，因此淀粉的透明度降低。

圖3 自然發(fā)酵對淀粉透明度影響

2.4 自然發(fā)酵對高粱直鏈淀粉含量的影響

2.4.1 直鏈淀粉標準曲線的繪制

在波長620 nm條件下測定溶液吸光度值，以直鏈淀粉質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖3，y=0.088 4x+0.657 4，其中相關系數(shù)R2=0.999 6，說明直鏈淀粉含量與吸光光度值有著良好的線性關系。

圖4 直鏈淀粉標準曲線

2.4.2 自然發(fā)酵對高粱直鏈淀粉含量的影響

高粱中直鏈淀粉的含量是影響淀粉理化性質的主要因素[15]，即直鏈淀粉有著很強的老化聚合趨勢，因此將未發(fā)酵和不同發(fā)酵時期的高粱淀粉進行直鏈淀粉含量的測定，經平行3次測定，其結果如圖5所示。

淀粉中直鏈淀粉質量分數(shù)為15%～25%[16]，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵樣品中直鏈淀粉的含量先降低后增加，其發(fā)生原因可能是發(fā)酵初期微生物進行生長繁殖，營養(yǎng)物質大量溶出，直鏈淀粉發(fā)生部分外溶現(xiàn)象，但隨著發(fā)酵時間的延長使部分支鏈淀粉發(fā)生一定程度的降解、脫支，直鏈淀粉含量出現(xiàn)明顯小幅度的回升趨勢，且略高于未發(fā)酵樣品直鏈淀粉含量。而袁美蘭等[17]對自然發(fā)酵玉米直鏈淀粉含量的變化結果表明發(fā)酵使直鏈淀粉變化趨勢不顯著，兩結果不同的原因可能是原料的不同或隨著發(fā)酵時間的延長高粱中的脂肪、蛋白質發(fā)生一定程度的降解，使直鏈淀粉含量升高。

圖5 自然發(fā)酵對高粱直鏈淀粉含量的影響

2.5 自然發(fā)酵對高粱淀粉老化性質的影響

高粱在一定溫度、加糖量的條件下進行自然發(fā)酵并與未發(fā)酵高粱淀粉進行對比，其RVA特征值有明顯變化(表1)，其中峰值黏度、衰減值隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，最終黏度與回生值均隨發(fā)酵時間的延長而出現(xiàn)先減小后增加的趨勢，此結果與袁美蘭[18]等人所研究結果相同。

淀粉是以葡萄糖聚合物的形式存在，高粱中的蛋白質將淀粉包裹起來使淀粉吸水膨脹受到一定程度的抑制，發(fā)酵可使蛋白質和脂肪發(fā)生一定程度的降解，淀粉吸水膨脹使其體積迅速增大，故峰值黏度增加。衰減值反應了淀粉顆粒在進行加熱處理時抗剪切力而維持分子內部結構穩(wěn)定性能力的大小，衰減值越大代表淀粉顆粒的穩(wěn)定性越差。通過Camargo等[19]、Chang等[20]、Han等[21]研究可知支鏈淀粉的長鏈含量與衰減值呈高程度的正相關，其變化趨勢發(fā)生原因可能是發(fā)酵產生的酶類物質對于蛋白質的降解程度逐漸趨于穩(wěn)定，使淀粉分子穩(wěn)定性增強，所以衰減值的變化為上升趨勢。最終黏度與回生值均隨發(fā)酵時間的延長而出現(xiàn)先減小后增加的趨勢，最終黏度是對淀粉糊在冷卻過程中在低剪切力作用下的穩(wěn)定程度的衡量，回生值反應淀粉的老化能力，即膨脹前期溶出的直鏈淀粉分子相互交聯(lián)結合能力的大小。淀粉的老化性質與直連淀粉的含量及支鏈鏈長的分布情況有關[22]，其中回生值降低的原因可能是短期發(fā)酵使直鏈淀粉分子的聚合程度降低，淀粉分子老化能力減小，但隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵底物酶及酸的積累使支鏈淀粉的長鏈部分水解為短鏈或直鏈淀粉，因此發(fā)酵后期回生值出現(xiàn)回升的趨勢。

2.6 自然發(fā)酵對高粱淀粉糊化性質的影響

通過淀粉的熱特征參數(shù)，能夠推斷出淀粉分子的結構變化，其中糊化溫度是結晶結構的定性指標，糊化焓是有序結構的定量指標，淀粉在發(fā)生糊化反應時，其中一些雙螺旋堆積的有序結構在高于糊化溫度時，發(fā)生不可逆膨脹現(xiàn)象，失去結晶結構[23]。表2表示淀粉的熱特征值隨發(fā)酵時間的延長所發(fā)生的變化，其中糊化溫度隨發(fā)酵時間的延長呈先降低后增加的趨勢，峰值溫度變化幅度較小，而熱晗值的大小隨時間的增加而呈先增加后降低的趨勢。

高粱中的蛋白質以蛋白體的形式存在淀粉顆粒中，使淀粉分子不能充分吸水膨脹，而發(fā)酵過程能有效的使部分蛋白質分解并析出，降低蛋白質對淀粉的束縛作用，加速淀粉的水化作用、促進糊化反應，提高淀粉分子的糊化速度，降低糊化溫度[24]，此外發(fā)酵能破壞淀粉的非結晶區(qū)域有效的減少脂類物質降低其與直鏈淀粉分子形成絡合物的概率，并由于非結晶區(qū)域的破壞，水分子更易滲透進入，使淀粉分子的糊化溫度降低。糊化焓的變化趨勢與糊化溫度呈負相關，其中發(fā)酵淀粉的熱晗值較未發(fā)酵最高降低11.31 J·g-1、增加34.42 J·g-1，其直接原因是發(fā)酵破壞了淀粉的非結晶區(qū)域，使淀粉分子水解而溶出，造成結晶結構的相對比例增加，糊化焓上升。

表1 自然發(fā)酵對淀粉老化性質的影響

表2 自然發(fā)酵對淀粉糊化性質的影響

3 結論

通過將高粱進行自然發(fā)酵使淀粉的糊化溫度降低，有利于高粱淀粉的糊化，而回生值在發(fā)酵前期一定程度的降低，較未發(fā)酵降低783 mPa·s，使高粱的抗老化性能得到大幅度的提高，使最后淀粉凝膠質地柔軟，彈性較小適合生產抗老化產品如饅頭、面包等產品，在發(fā)酵后期淀粉的回生值高于未發(fā)酵樣品，此時較適合生產如粉絲等產品。通過將高粱進行發(fā)酵處理擴大了高粱的應用范圍，充分利用其經濟價值，開闊了高粱淀粉的應用領域，該實驗為發(fā)酵高粱的應用提供了理論基礎，也為進一步的工業(yè)化設計提供數(shù)據(jù)支持。