楊 帆 肖華西 林親錄 張 倩 王素艷 羅非君 葉 雅

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410004)

抗性淀粉(resistant starch，RS)是指不被健康人體小腸吸收的淀粉及其分解物的總稱(chēng)[1]，具有良好生理功能，可抑制餐后血糖快速升高，減少血清中膽固醇和甘油三酸酯的量，并能有效促進(jìn)腸道中有益菌的生長(zhǎng)和繁殖[2-5]。盡管RS的種類(lèi)很多，但RS1和RS2由于性質(zhì)不穩(wěn)定會(huì)在加工過(guò)程中造成大量損失，而RS3卻是淀粉經(jīng)糊化后由于老化(回生)作用而形成的一類(lèi)特殊的淀粉結(jié)構(gòu)[6]，因此RS3有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，并引起了人們的普遍關(guān)注。目前，大米R(shí)S3型抗性淀粉制備方法主要有酸變性和水熱處理[7]、酶法處理[8]和壓熱處理[9]等，這些單一處理使大米淀粉整體降解性差，RS3得率普遍偏低。本研究采用超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備大米R(shí)S3型抗性淀粉，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選出最佳工藝條件，為RS3的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料

東北粳米淀粉：無(wú)錫市天之源食品有限公司，抗性淀粉約占0.67%。

1.2 試劑

無(wú)水乙醇(分析純)：天津市富于精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉、氫氧化鉀(均為分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；檸檬酸(食品級(jí))：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；氯化鉀(分析純)、順丁烯二酸(化學(xué)純)、二水氯化鈣(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸(分析純)：湖南匯虹試劑有限公司；抗性淀粉檢測(cè)試劑盒：上海超研生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

101C-2AB電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；400T多功能粉碎機(jī)：鉑歐五金廠；DZKW-4恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；FS-250超聲波處理器：上海生析超聲儀器有限公司；L530臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；722 s可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Super4 RVA快速黏度分析儀：澳大利亞Newport Scientific儀器公司；Multizoom AZ100/AZ100M多功能顯微鏡：尼康儀器(上海)有限公司；濕熱反應(yīng)罐：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.4 方法

1.4.1 超聲波-濕熱法制備RS3

1.4.1.1 制備工藝

稱(chēng)取一定量的大米淀粉，加入適量蒸餾水，配成不同濃度的淀粉懸浮液，將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，調(diào)節(jié)烘箱溫度，烘烤一定時(shí)間，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨過(guò)100目篩。

1.4.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇影響RS3得率的3個(gè)主要因素:含水量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間。

1)含水量對(duì)RS3得率的影響。稱(chēng)取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量分別為20%、25%、30%、35%、40%，將大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中，110 ℃烘烤10 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨過(guò)100目篩, 測(cè)定各樣品的RS3含量。

2)反應(yīng)溫度對(duì)RS3得率的影響。稱(chēng)取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量為25%。將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中，溫度分別設(shè)置為100、110、120、130、140 ℃，烘烤10 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏24 h，烘干，研磨過(guò)100目篩, 測(cè)定各樣品的RS3含量。

3)反應(yīng)時(shí)間對(duì)RS3得率的影響。稱(chēng)取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量為25%。將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中，在110 ℃分下別烘烤8、10、12、14、16 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨過(guò)100目篩, 測(cè)定各樣品的RS3含量。

1.4.1.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，每個(gè)因素各選出3個(gè)水平，采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn) L9(34)，以確定最佳工藝條件。

1.4.2 超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備RS3

1.4.2.1 制備工藝

稱(chēng)取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量為30%。將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制的濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中烘烤,在130 ℃下烘烤10 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，加入一定濃度檸檬酸混勻，放入100 ℃的水浴鍋中加熱一定時(shí)間，冷卻置于4 ℃的冰箱老化一定時(shí)間，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過(guò)100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過(guò)100目篩。

1.4.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在超聲波-濕熱法制備RS3實(shí)驗(yàn)的最佳工藝條件基礎(chǔ)上，綜合考察和分析了各影響因素在酸水解過(guò)程中對(duì)RS3得率的影響，確定以酸的濃度、加熱時(shí)間、老化時(shí)間為主要考察因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1)酸的濃度對(duì)RS3得率的影響。樣品經(jīng)最佳超聲波-濕熱法條件處理后，分別加入濃度為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L的檸檬酸溶液，按淀粉∶酸為2∶3的比例在100 mL燒杯中混合均勻。將混合物放置于100 ℃的恒溫水浴鍋中加熱攪拌20 min，冷卻至室溫后置于4 ℃的冰箱老化36 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過(guò)100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過(guò)100目篩, 測(cè)定各樣品的RS3含量。

2)加熱時(shí)間對(duì)RS3得率的影響。樣品經(jīng)最佳超聲波-濕熱法條件處理后，加入濃度為0.15 mol/L的檸檬酸溶液，按淀粉∶酸為2∶3的比例在100 mL燒杯中混合均勻。將混合物放置于100 ℃的恒溫水浴鍋中分別加熱攪拌10、15、20、25、30 min，冷卻至室溫后置于4 ℃的冰箱老化36 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過(guò)100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過(guò)100目篩, 測(cè)定各樣品的RS3含量。

3)老化時(shí)間對(duì)RS3得率的影響。樣品經(jīng)最佳超聲波-濕熱法條件處理后，加入濃度為0.15 mol/L的檸檬酸溶液，按淀粉∶酸為2∶3的比例在100 mL燒杯中混合均勻。將混合物放置于100 ℃的恒溫水浴鍋中加熱攪拌20 min，冷卻至室溫后置于4 ℃的冰箱中分別老化12、24、36、48、60 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過(guò)100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過(guò)100目篩, 測(cè)定各樣品的RS3含量。

1.4.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)每一種影響因素篩選3個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以確定最佳的工藝條件。

1.4.3 RS含量的測(cè)定

參照抗性淀粉試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行測(cè)定[10-11]。

抗性淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=ΔE×F/W×0.1×0.9×100%

式中：ΔE：空白試劑的吸光度值；F：D-葡萄糖含量除以D-葡萄糖的吸光度值；W：樣品質(zhì)量/g。

1.4.4 大米抗性淀粉的理化性質(zhì)的測(cè)定

1.4.4.1 含水量測(cè)定[12]

式中：m0：稱(chēng)量瓶的質(zhì)量/g；m1：稱(chēng)量瓶和試樣的質(zhì)量/g；m2：稱(chēng)量瓶和試樣干燥后的質(zhì)量/g。

1.4.4.2 溶解性測(cè)定

將淀粉懸浮液在30 ℃的水浴鍋中攪拌30 min，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，棄去上清液，將沉淀在105 ℃下烘干稱(chēng)重，即得水溶淀粉的質(zhì)量。

式中：X0：淀粉樣品干質(zhì)量；X1：水溶淀粉質(zhì)量。

1.4.4.3 膨潤(rùn)力測(cè)定

按照1.4.4.2中的方法，所得沉淀為膨脹淀粉，稱(chēng)其質(zhì)量即為膨脹淀粉的質(zhì)量。

式中：X0：淀粉樣品干質(zhì)量/g；X1：水溶淀粉質(zhì)量/g；X2：膨脹淀粉質(zhì)量/g。

1.4.4.4 糊化性質(zhì)測(cè)定

采用RVA快速黏度分析儀測(cè)定：樣品含水量在14%時(shí)，稱(chēng)取3 g樣品，加入到裝有25.0 mL蒸餾水的鋁罐中，按此標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)樣品水分含量稱(chēng)取準(zhǔn)確的樣品量及蒸餾水。參數(shù)設(shè)置由Thermocline for windows軟件控制。

1.4.4.5 偏光顯微鏡觀察

將少量淀粉懸浮于1 mL去離子水中，吸取一滴淀粉溶液滴在載玻片上，輕輕將蓋玻片蓋上，將氣泡趕出。選擇合適的物鏡及放大倍數(shù)對(duì)抗性淀粉和原大米淀粉進(jìn)行偏光十字和形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，采用 Origin、SPSS statistics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波-濕熱法制備RS3最佳工藝條件

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，淀粉含水量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間不同，RS3的得率也不同。超聲處理對(duì)淀粉產(chǎn)生“空化效應(yīng)”，在高溫高壓下加劇淀粉分子與溶劑分子間的摩擦，使直鏈淀粉、支鏈淀粉溶出，導(dǎo)致淀粉鏈破裂，有利于生成抗性淀粉。后經(jīng)濕熱處理，RS3的得率在含水量為25%時(shí)最大，其后隨淀粉含水量增大而減小。這主要是因?yàn)楫?dāng)含水量低于25%時(shí)，整個(gè)體系的黏度很低，直鏈分子之間彼此接觸的概率??；當(dāng)含水量大于25%時(shí)，淀粉糊的黏度很大，沒(méi)有足夠的水分子進(jìn)入淀粉的結(jié)晶區(qū)，氫鍵破壞不完全，淀粉分子難以充分糊化，阻礙了直鏈淀粉分子相互接近并形成結(jié)晶，不利于RS3的形成[13-14]。濕熱處理的溫度是影響RS3得率的主要因素之一。當(dāng)溫度為110 ℃時(shí)RS3得率達(dá)到最大，高于110 ℃之后，RS3得率開(kāi)始減少。高溫為淀粉分子提供了大量的能量，有利于淀粉分子鏈的遷移，冷卻后淀粉分子形成新的聚合體成為RS3，但隨著溫度升高，過(guò)高的溫度導(dǎo)致直鏈淀粉過(guò)度降解，產(chǎn)生的淀粉聚合度小，也不利于RS3的形成。隨著濕熱反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在10 h時(shí)RS3得率達(dá)到最大，之后逐漸減少。濕熱處理時(shí)間過(guò)短，淀粉粒中的直鏈淀粉分子游離不完全；當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)10 h后，直鏈淀粉分子過(guò)度降解成一些分子質(zhì)量小的短直鏈淀粉分子鏈，分子鏈擴(kuò)散速度快，難以聚集，這都不利于形成RS3[15-16]。

圖1 超聲波-濕熱處理對(duì)抗性淀粉含量的影響

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1所示，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，各因素的R值均大于空列R值，表明每個(gè)因素對(duì)RS3得率的影響都是有效的。這3個(gè)因素對(duì)RS3得率影響的主次順序?yàn)椋築(反應(yīng)溫度)>A(含水率)>C(反應(yīng)時(shí)間)。最優(yōu)組合為A2B3C1，即含水率為30%，處理溫度為130 ℃，處理時(shí)間為10 h,RS3的得率最高，為32.173%。

表1 超聲波-濕熱法制備大米抗性淀粉工藝條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表

2.2 超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備RS3最佳工藝條件

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，檸檬酸濃度為0.15 mol/L時(shí)RS3得率達(dá)到最大。酸濃度過(guò)低，淀粉分子無(wú)法水解為合適的分子鏈長(zhǎng)度，影響直鏈淀粉分子間的雙螺旋結(jié)構(gòu)生成。酸濃度過(guò)高，淀粉過(guò)度水解，分子鏈過(guò)短，小分子運(yùn)動(dòng)強(qiáng)烈，擴(kuò)散速度快，不易形成有序結(jié)晶，RS3得率減少[17-19]。隨著加熱時(shí)間逐漸增加，RS3得率也隨之增大，當(dāng)加熱時(shí)間達(dá)20 min時(shí)，RS3得率最大，之后開(kāi)始下降。加熱時(shí)間過(guò)短，淀粉中直鏈分子未能完全游離出來(lái)，而加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，直鏈分子水解過(guò)度，產(chǎn)生小分子質(zhì)量的直鏈淀粉，不易聚集結(jié)晶[17,20]。老化時(shí)間在36 h時(shí)RS3得率最大。老化時(shí)間短，晶核形成和晶體生長(zhǎng)不完全，老化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，淀粉糊黏度增大，晶體生長(zhǎng)受抑制，直鏈淀粉難以重結(jié)晶，導(dǎo)致RS3得率下降。

圖2 超聲波酸熱處理對(duì)抗性淀粉含量的影響

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)因素和水平如表3所示，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。3個(gè)因素對(duì)RS3得率的影響的主次順序?yàn)椋篈(檸檬酸濃度)>B(加熱時(shí)間)>C(老化時(shí)間)。最佳工藝條件為A3B2C1，即檸檬酸濃度為0.15 mol/L，加熱時(shí)間為20 min，老化時(shí)間為24 h,RS3的得率最高，為40.672%。

表3 超聲波酸熱法制備大米抗性淀粉工藝條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表4 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，在超聲波-濕熱法最佳工藝基礎(chǔ)之上結(jié)合酸水解明顯提高了RS3的得率。這是因?yàn)樗崮苓M(jìn)一步水解無(wú)定形支鏈淀粉，破壞支鏈淀粉的α-1,6鍵，同時(shí)對(duì)α-1,4鍵也有一定的裂解作用，使酸得以進(jìn)一步滲入和水解并形成短直鏈淀粉，有利于RS3的生成。

2.3 大米抗性淀粉理化性質(zhì)

2.3.1 含水量

原大米淀粉、超聲波-濕熱法制備的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3的含水量分別是13.91%、9.24%、6.05%；超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3含水量最低，更容易儲(chǔ)存，不容易變質(zhì)，保質(zhì)期更長(zhǎng)；調(diào)漿時(shí)，更容易上漿，漿液濃度更準(zhǔn)確。

2.3.2 溶解性

原大米淀粉、超聲波-濕熱法制備的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3的溶解性分別是5.16%、1.96%、0.25%。RS3在形成過(guò)程中，由于脫支化作用，使得抗性淀粉中直鏈淀粉含量大于原大米淀粉，且RS3抗性淀粉顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較致密，水分子不易進(jìn)入，所以造成溶解性變小。超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3溶解性最低，更易形成抗性淀粉[6,21]。

2.3.3 膨潤(rùn)力

原大米淀粉、超聲波-濕熱法制備的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3膨潤(rùn)力分別是0.667 6、0.611 1、0.580 3 g/g。RS3淀粉顆粒內(nèi)部由于結(jié)構(gòu)比較致密，水分子不易進(jìn)入，持水力降低，所以導(dǎo)致膨潤(rùn)力變小。超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的抗性大米淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)更為致密，膨潤(rùn)力最小[6,22]。

2.3.4 糊化性質(zhì)

糊化性質(zhì)表示了淀粉糊化的難易程度。由表5、圖3可知，超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3的峰值黏度、保持黏度、最終黏度、回生值、衰減度與其他兩種淀粉相比值最低，呈現(xiàn)極顯著性差異，說(shuō)明有較好的熱穩(wěn)定性。雖然峰值時(shí)間降低，但糊化溫度較原大米淀粉有所升高。超聲波-濕熱法制備的RS3峰值時(shí)間和糊化溫度均較原大米淀粉有升高。

由于在制備RS3的過(guò)程中的脫支化作用，分子間鍵發(fā)生斷裂而造成結(jié)構(gòu)脆弱，絕大部分轉(zhuǎn)化為取向單一的直鏈淀粉，且流動(dòng)性大，所以造成了結(jié)果的差異[20-21,23]。

圖3 RVA特征曲線

2.3.5 偏光顯微觀察

淀粉顆粒內(nèi)部存在著結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無(wú)定型結(jié)構(gòu)這兩種結(jié)構(gòu)，在結(jié)晶區(qū)淀粉分子鏈有序排列，而在無(wú)定型區(qū)淀粉分子無(wú)序排列，這兩種結(jié)構(gòu)在密度和折射率上存在差異，產(chǎn)生各向異性，從而偏振光通過(guò)淀粉顆粒時(shí)形成偏光十字。如圖4～圖6所示，原大米淀粉顆粒比較分散，很容易觀察到偏光十字，經(jīng)過(guò)超聲波-濕熱和酸水解處理后，淀粉顆粒都出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，雖然處理后淀粉的偏光十字依然存在，但超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解較超聲波-濕熱處理所制備的RS3更為分散，更容易看見(jiàn)偏光十字。

圖4 原大米淀粉

表5 三種淀粉間的RVA譜特征值差異

淀粉樣品峰值黏度保持黏度衰減度最終黏度回生值峰值時(shí)間糊化溫度A平均值 3 141 2 275 8663 877 1 602 6.0777.55 B平均值 1 005 8421631289 4477 92.2C平均值 24617472 3151415.53 79.9A變異系數(shù)/%15.4310.7712.43 6.69 11.442.9810.96B變異系數(shù)/% 7.616.4210.45 4.56 7.21 2.83 9.08C變異系數(shù)/% 6.10 4.34 5.14 5.65 9.32 2.24 11.44ta-b 7.27**8.07** 6.69** -15.92**-10.06**1.403.37**ta-c10.17**-5.37** 15.92** -18.68** -18.45**1.13 2.67**tb-c2.77* 2.15* 2.43*-2.49*-2.36* 2.46*1.25

注：*顯著性差異，**：極顯著性差異；A、B、C分別表示原大米淀粉、超聲波-濕熱法制得的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制得的RS3；ta-b、ta-c、tb-c分別表示a與b、a與c、b與c之間 RVA 特征值的差異。

圖5 超聲波-濕熱法制備的RS3型大米抗性淀粉

圖6 超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3型大米抗性淀粉

3 結(jié)論

超聲波-濕熱法制備RS3的最佳工藝條件：含水量30%、反應(yīng)溫度130 ℃、反應(yīng)時(shí)間10 h，RS3的得率達(dá)到32.173%，其中反應(yīng)溫度是影響得率的最主要因素。在此基礎(chǔ)上結(jié)合酸水解制備RS3最佳工藝條件：檸檬酸濃度0.15 mol/L、加熱時(shí)間20 min、老化時(shí)間24 h，RS3的得率達(dá)到40.672%，其中檸檬酸濃度是影響得率的最主要因素。

研究表明，在超聲波-濕熱法最佳工藝條件基礎(chǔ)上再進(jìn)行酸水解，其所制備的RS3具有得率高、含水率低、易儲(chǔ)存、結(jié)構(gòu)致密、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。