陳蔚燕

(青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院, 山東 青島 266109)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinen-sis( Turcz. ) Baill. 的干燥成熟果實, 其性酸、甘、溫[1-3], 具有益氣、斂肺、生津、止渴、止瀉、斂汗、壯陽、補腎等功能[4-5]，關(guān)于五味子在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥方面的藥理研究比較多[6-8]。五味子具有殺菌抑菌的作用，但研究主要集中在其對醫(yī)學細菌的抑制活性方面[9-12]，關(guān)于其對農(nóng)作物病原真菌的活性研究較少。目前農(nóng)業(yè)上對植物病害的防治仍主要依靠化學殺菌劑，為了開發(fā)植物源農(nóng)藥，本文以五味子為試材，對其提取物進行抑菌活性研究，為五味子作為殺菌劑應用于農(nóng)業(yè)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料 五味子(青島市同方大藥房)，瓊脂(國藥集團化學試劑有限公司), 葡萄糖(天津市光復科技發(fā)展有限公司)，無水乙醇(天津市大茂化學試劑廠)，丙酮(萊陽市康德化工有限公司)，乙酸乙酯(天津市大茂化學試劑廠)；柑橘炭疽病菌、棉花枯萎病菌、小麥全蝕病菌、白菜灰斑病菌、辣椒炭疽病菌等植物病原真菌的菌種均由山東省農(nóng)業(yè)仿生應用工程技術(shù)研究中心提供，菌種使用前均進行復壯培養(yǎng)。

1. 2 儀器與設備 FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，250D恒溫光照培養(yǎng)箱(常州市華普達教學儀器有限公司)，SW--CG--2FD型凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，WD900B型微波爐(順德市格蘭仕微波電器有限公司)，101C-3型電熱鼓風干燥箱(上海市實驗儀器總廠)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-D循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市英峪豫華儀器廠)，電子分析天平(美特勒-托利多儀器上海有限公司)，XH-100A型微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)。

1.3方法

1.3.1 五味子索式提取法提取物的制備方法 將五味子烘干至恒重，粉碎，稱取粉碎的五味子樣品適量于250 mL 三頸燒瓶中, 加入適量的丙酮，置于索氏提取器上浸提。過濾得到上清液，合并上清液，得到五味子提取液，提取液經(jīng)旋蒸濃縮干燥，得提取物，置于4℃冰箱保存，備用。

1.3.2 五味子微波正交提取法提取物的制備方法 稱取粉碎的樣品適量, 置于250 mL 三頸燒瓶中, 加入適量的萃取溶劑，并置于微波腔中, 裝上冷凝管, 在MDS-8G型微波萃取系統(tǒng)中, 用相應的功率于適當?shù)妮腿r間和適當?shù)妮腿囟认逻M行微波萃取。萃取完成后，稍冷，旋蒸濃縮。按照如下設計的L9(34)正交實驗進行，正交因素水平(表1)。

表1 正交因素水平表

1.3.3 菌絲生長速率法對抑菌效果的測定 采用菌絲生長速率法測定五味子提取物的抑菌活性。將提取物用移液槍移取一定的母液加入100 mL 培養(yǎng)基內(nèi)配成相應濃度，每組實驗均作對照。在超凈工作臺上把培養(yǎng)基倒入直徑為 6 cm 或 7.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)制成含藥平板備用，用接種針把打好孔的活化菌絲塊接到制備好的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個處理重復3次，薄膜包好，放入恒溫 27 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 3 d 左右。待對照組 (CK) 里的菌餅長到培養(yǎng)皿 2/3 左右時，用十字交叉法測量各個菌落直徑，計算各提取物的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 索式提取法五味子丙酮提取物抑菌效果 五味子丙酮提取物抑菌數(shù)據(jù)(表2)，從對各個病菌的抑菌率可以看出，隨著五味子濃度的增大，抑菌率增大。其中對白菜灰斑病菌的抑制效果最好，在8.00 mg/mL時的抑菌活性達到88.64%。

表2 五味子丙酮提取物對5種不同病原菌的抑菌率(%)

2.2 不同提取條件對五味子提取物抑菌活性的影響 根據(jù)實驗方案選用3水平4因素正交設計，五味子的乙醇、丙酮、乙酸乙酯微波提取液采取4.00 g/L濃度，測定其對棉花枯萎病菌的抑菌活性，實驗結(jié)果(表3)。

表3 五味子微波提取物在4.00 g/L下對棉花枯萎病菌抑制活性正交設計表

注：試驗號1-9指的是做了9次不同因素的實驗

從表3可以看出五味子丙酮提取液在4.00 g/L濃度下對棉花枯萎病菌均有一定的抑菌作用。五味子丙酮提取液最高抑菌率約達69.9%。通過極差R分析，可以看出五味子提取物對真菌抑制最佳方案為：溶劑丙酮，功率400 W，樣品與溶劑比5:70，反應時間5 min。

2.3 五味子微波提取物對小麥全蝕病菌的抑菌活性 取五味子的微波提取物加入滅菌的PDA培養(yǎng)基中，配制含藥濃度梯度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、10 mg/mL的含藥平板，采用上述的菌絲生長速率法測定抑菌活性，并求出對各菌種的EC50。五味子提取物對小麥全蝕病菌的抑菌作用(圖1)。

圖1 五味子對小麥全蝕病菌的抑菌數(shù)據(jù)圖

從圖1結(jié)果可以看出，五味子丙酮提取物對小麥全蝕病菌的抑制效果是隨著濃度的增加而增加，五味子丙酮提取物對小麥全蝕病菌的有效抑制中濃度EC50為2.83 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.970 8。

3 總結(jié)

本實驗采用浸提法和正交試驗微波方式對五味子進行了提取，并對其提取液進行了抑制病原真菌活性的實驗，供試菌種為柑橘炭疽、小麥全蝕和棉花枯萎等幾種真菌，從實驗中測得索式提取法丙酮提取五味子提取液的抑菌活性，通過抑菌數(shù)據(jù)可知，在浸提法中五味子對5種植物病原真菌都有抑制作用，且隨著五味子濃度的增大抑菌率增大。在微波提取中以萃取功率400 W，萃取時間5 min，樣品與溶劑比5:70，溶劑為丙酮時為最佳提取工藝，同時求出了五味子提取液對小麥全蝕病原真菌的有效抑制中濃度。五味子的微波提取物對幾種真菌具有抑菌效果，本實驗與文獻[13]中所描述的石菖蒲的微波抑菌效果相比，具有更高的抑菌率。本研究為五味子今后應用于農(nóng)業(yè)和開發(fā)植物源農(nóng)藥殺菌劑提供了一定的指導意義。