程杰，張新圣，李安琪，姜晶

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番茄果實(shí)成熟過程中的功能分析

程杰，張新圣，李安琪，姜晶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/遼寧省設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110866）

【目的】SWEETs（sugars will eventually be exported transporters）是一種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與植物生物進(jìn)程，對(duì)植物生長發(fā)育、響應(yīng)各種脅迫、宿主-病原體的互作發(fā)揮作用?？寺》?，通過構(gòu)建沉默和過表達(dá)載體，研究其在糖的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用，為探索SWEETs在植物果實(shí)發(fā)育過程中的功能提供理論依據(jù)。【方法】以Micro-Tom（）番茄為試材，利用RT-PCR技術(shù)從果實(shí)中克隆的cDNA全長842bp，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用MEGA6.0構(gòu)建擬南芥進(jìn)化樹，與SlSWEET7a進(jìn)行蛋白序列同源性分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探明其在果實(shí)發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)特征分析，并構(gòu)建基因的沉默和過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的果實(shí)注射法進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)檢測構(gòu)建載體的表達(dá)效率；然后進(jìn)行番茄的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得T1代轉(zhuǎn)基因株系，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測綠熟期果實(shí)的表達(dá)，通過高效液相色譜法檢測轉(zhuǎn)基因果實(shí)和葉片中糖組成與含量的變化?！窘Y(jié)果】SlSWEET7a蛋白結(jié)構(gòu)是由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的。同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，SlSWEET7a與擬南芥AtSWEET6和AtSWEET8序列同源性較高，都屬于SWEETs家族的CladeⅡ。番茄果實(shí)各部位的表達(dá)分析顯示，在綠熟期果柄、果實(shí)維管束相對(duì)表達(dá)量最高，轉(zhuǎn)色期和紅熟期相對(duì)表達(dá)量較低。構(gòu)建沉默（S7a）及過表達(dá)載體（OE7a）在番茄果實(shí)的瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OE7a樣品果實(shí)中的表達(dá)量是未注射果實(shí)的6倍，其表達(dá)量明顯上調(diào)，與對(duì)照相比，S7a樣品果實(shí)中明顯下調(diào)了5倍。在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化中卡那霉素抗性篩選獲得10株可能的超表達(dá)T0代植株，PCR鑒定得到了超表達(dá)8株；沉默株系經(jīng)除草劑篩選，獲得14株，PCR檢測得到10株沉默株系。T1代植株的實(shí)時(shí)定量分析顯示，過表達(dá)植株發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象，表達(dá)量顯著低于正常植株，而沉默植株表達(dá)量也降低，說明獲得的過表達(dá)植株也發(fā)生了基因沉默。果糖、葡萄糖和蔗糖含量測定結(jié)果表明，降低番茄中的表達(dá)，植株成熟葉片和綠熟期果實(shí)中果糖、葡萄糖和蔗糖含量均高于對(duì)照，尤其是葉片中蔗糖含量顯著高于對(duì)照，這說明對(duì)細(xì)胞中蔗糖的易化擴(kuò)散起著重要作用?！窘Y(jié)論】SlSWEET7a對(duì)葉片中蔗糖向源組織韌皮部的裝載及果實(shí)果柄、維管束的運(yùn)輸、卸載起重要調(diào)控作用。

番茄；SWEET7a；糖轉(zhuǎn)運(yùn)；載體構(gòu)建；表達(dá)分析

0 引言

【研究意義】植物的碳水化合物在源器官（成熟葉片）中合成，主要以蔗糖的形式通過韌皮部進(jìn)行長距離運(yùn)輸，然后將這些不同的化合物運(yùn)輸?shù)綆炱鞴伲ㄓ啄廴~片、根尖、果實(shí)）來維持異養(yǎng)代謝和生長[1-2]。糖的代謝和分配在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和植物響應(yīng)生物和非生物因子中發(fā)揮著重要的作用[3]。番茄作為世界性范圍種植的茄果類蔬菜，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其果實(shí)含糖量對(duì)風(fēng)味和品質(zhì)有著重要影響，并且直接影響了商品番茄及其番茄加工產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值。在植物的生長發(fā)育過程中，來自SWEET家族的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能調(diào)節(jié)糖的運(yùn)輸，影響果實(shí)糖的積累。因此，研究番茄對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及其調(diào)控機(jī)理對(duì)于人們利用調(diào)控手段促進(jìn)果實(shí)糖分積累、改善果實(shí)品質(zhì)具有重要的理論意義。【前人研究進(jìn)展】SWEETs是一類新發(fā)現(xiàn)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于原核生物、人類、植物以及動(dòng)物中，擬南芥有17個(gè)SWEET家族成員，水稻有21個(gè)家族成員，番茄有29個(gè)家族成員[4-6]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析植物SWEET基因家族有4個(gè)分支，分別為CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ和CladeⅣ。其中CladeⅠ（SWEET1—SWEET3）作為己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖；CladeⅡ（SWEET4—SWEET8）主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖；CladeⅢ（SWET9—SWEET15）主要轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖；CladeⅣ（SWEET16—SWEET17）是一種液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)果糖[7]。SWEETs作為糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與不同組織和器官中糖類的交換和運(yùn)輸，對(duì)植物花器官、花蜜分泌和花粉的發(fā)育起著重要的作用[4]。如、、和參與生殖器官的發(fā)育，與花粉發(fā)育和花蜜分泌進(jìn)程有關(guān)[8-11]。在花器官的表達(dá)部位不同，擬南芥和主要在雄蕊中表達(dá)，主要在花瓣中表達(dá)；水稻在圓錐花序和花藥中表達(dá)[12-14]。、和，在擬南芥的種子發(fā)育中表現(xiàn)出特異性時(shí)空表達(dá)模式，它們的三突變體顯示出嚴(yán)重的種子缺陷，包括胚乳發(fā)育延遲、種子重量減少和淀粉含量降低，在種子成熟期表現(xiàn)出明顯的表型[8,15]。水稻中的RNA干擾會(huì)導(dǎo)致花粉發(fā)育不良，進(jìn)而引起雄性不育，降低穎果中的淀粉含量[16]，導(dǎo)致種子表面褶皺，重量減少。的突變體植株后代呈現(xiàn)種子變小，部分表型生長推遲[17]。在玉米和水稻種子灌漿期和負(fù)責(zé)己糖跨基部的胚乳轉(zhuǎn)換層進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[18]；而擬南芥調(diào)節(jié)糖從源到庫的運(yùn)輸，受到抑制會(huì)降低源器官的糖含量[19]。水稻參與半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，其過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致半乳糖代謝機(jī)制發(fā)生改變，從而引起植株生長延遲、根長變短[20]。水稻和擬南芥等在花器官和特定發(fā)育階段表達(dá)，參與單糖和二糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，這表明各自在調(diào)控植物生殖生長過程發(fā)揮不同的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，雖已在擬南芥和水稻花器官和種子方面鑒定了SWEETs部分成員的生理功能，對(duì)調(diào)控作物產(chǎn)量形成中碳素分配具有重要意義，但在以果實(shí)作為糖積累器官的重要蔬菜作物-如番茄上有關(guān)SWEETs的相關(guān)報(bào)道較少。前期研究發(fā)現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育時(shí)期尤其是綠果期大量表達(dá)，在其他部位表達(dá)量極低[6]。相比較植物源端韌皮部裝載和運(yùn)輸途徑的研究，尚無SWEETs蛋白在番茄果實(shí)庫器官中介導(dǎo)蔗糖供給與代謝積累的生理功能和調(diào)控機(jī)理報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得沉默和過表達(dá)植株，在對(duì)的表達(dá)量與果實(shí)中糖的分析基礎(chǔ)上，探究轉(zhuǎn)運(yùn)糖的作用機(jī)制，進(jìn)一步了解的功能，有助于為番茄果實(shí)品質(zhì)的改良提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年9月至2017年12月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種為Micro-Tom（），試材取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜分子生物學(xué)番茄課題組。所用菌株和質(zhì)粒：大腸桿菌菌株DH5α（TARATA，Japan）、農(nóng)桿菌菌株LBA4404（TARATA，Japan）、具有氨芐霉素（Amp）抗性的pENTR/D-TOPO（Invitrogen，USA）質(zhì)粒、具有壯觀霉素（Spe）抗性的pB7GWIWG2(I)（Invitrogen），含有篩選標(biāo)記基因Ⅱ新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因卡那霉素（Kan）抗性的pBI121質(zhì)粒。

1.2 番茄SlSWEET7a全長的獲得

根據(jù)NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的cDNA序列用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增特異引物。以Micro-Tom番茄果實(shí)為試驗(yàn)材料，利用RNAprep pure Plant Kit試劑盒（TIANGEN）提取總RNA，利用FastKing RT Kit（With gDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃30 s；98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。

1.3 SlSWEET7a表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

1.3.1 超表達(dá)載體構(gòu)建 利用正向F引物（5′-CCCCCGGGACATAGCTATGACTTTTAATAG-3′）和反向R引物（5′-TGAAAAACAGAAGGCCCAA T-3′）進(jìn)行PCR。反應(yīng)程序?yàn)?8℃30 s；98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶進(jìn)行膠回收純化產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和HⅠ進(jìn)行雙酶切，即30℃30 min；85℃15 min。將兩者用T4連接酶進(jìn)行連接，通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單一、大小合適的菌落于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，測序成功后用TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit試劑盒（TIANGEN）提取重組質(zhì)粒。

1.3.2 沉默載體構(gòu)建 根據(jù)的特異性序列，設(shè)計(jì)S7a-F引物（5′-CACCTGATGCCTACATTCT CGCACC-3′）和S7a-R引物（5′-TCCTTTAGCCTCTC TTGCTGCC-3′）進(jìn)行特異片段擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?8℃30 s；98℃10 s，60℃15 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃10min。獲得的PCR產(chǎn)物利用Gateway技術(shù)與中間載體pENTR/D-TOPO連接，形成pENTR/D-TOPO–SWEET7a載體，測序鑒定正確后與終載體pB7GWIWG2（Ⅰ）進(jìn)行LR反應(yīng)。轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒。

1.3.3 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 采用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。將構(gòu)建好的pBI121-35S-和pB7GWIWG2（Ⅰ）-35S-質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌感受態(tài)LBA4404中，分別涂在含有50 mg?L-1Kan和25 mg?L-1利福平（Rif）與75 mg?L-1壯觀霉素（Spe）和25 mg?L-1Rif的YEB固體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)20 h，然后在搖箱中以220 r/min搖到OD600=0.6。菌液測序成功后用于番茄的遺傳轉(zhuǎn)化。菌液儲(chǔ)存在50%的甘油中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 過表達(dá)載體和沉默載體的瞬時(shí)表達(dá)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的果實(shí)注射法進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，取Micro-Tom綠熟期果實(shí)，用一次性注射器吸取1 mL分別含有過表達(dá)載體和沉默載體的菌液緩慢注入果實(shí)中，黑暗條件下培養(yǎng)24 h后，在光照下培養(yǎng)3 d后進(jìn)行取樣和果實(shí)總RNA提取，最后進(jìn)行qRT-PCR分析的表達(dá)量。

1.5 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

參照Guo等[21]建立的番茄遺傳再生體系，采用葉盤法將沉默和過表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄。將無菌番茄子葉切成0.5 cm2的小塊，正面朝下置于預(yù)培養(yǎng)基上（MS+15 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂），25℃暗培養(yǎng)2 d后，將預(yù)培養(yǎng)的外植體浸入用MS液體培養(yǎng)基稀釋的農(nóng)桿菌懸浮液中5 min（浸染濃度OD600=0.6），用無菌濾紙吸去外植體表面多余菌液，放置共培養(yǎng)基（MS+30 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂+20 mg?L-1乙酰丁香酮）中，暗培養(yǎng)2 d；然后轉(zhuǎn)入生芽培養(yǎng)基（MS+30 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂+ 1 mg?L-16-芐基腺嘌呤+0.2 mg?L-13-吲哚乙酸）中25℃，1 800 lx光強(qiáng)的條件下培養(yǎng)兩周后，再轉(zhuǎn)入新的生芽培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)；待培養(yǎng)45天左右，轉(zhuǎn)化的抗性芽長至2—3 cm時(shí)，將芽切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+30 g?L-1蔗糖+7 g?L-1瓊脂+0.05 mg?L-1α-萘乙酸）中誘導(dǎo)生根，將生根良好的T0代植株移到營養(yǎng)液中（山崎配方）遮蔭保濕，煉苗3 d，然后將植株種植到基質(zhì)中，放置25℃，1800 lx光強(qiáng)，16 h光照/8 h黑暗的光照培養(yǎng)室中生長。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

采用DNAsecure Plant Kit試劑盒（TIANGEN）提取轉(zhuǎn)基因植株成熟葉片總DNA。沉默陽性植株鑒定以表達(dá)載體pB7GWIWG2（I）的除草劑抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，通過設(shè)計(jì)Bar-F（5′-GAAGTCCAGCT GCCAGAAA-3′）和Bar-R（5′-CACCATCGTCAACCA CTACAT-3′），進(jìn)行PCR檢測，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。過表達(dá)陽性植株的鑒定利用pBI121載體上的標(biāo)記基因設(shè)計(jì)引物，用Kan-F（5′-GT CATACCACTTGTCCGCCCT-3′）和Kan-R（5′-GACC ACCTATGATGTGGAACGGGAAAA-3′）引物對(duì)過表達(dá)植株進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5 min；94℃30 s，59℃32 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。野生型植株作陰性對(duì)照。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測儀檢測。

1.7 糖含量的測定

取0.5 g鮮樣采用液相色譜測定法對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株的綠熟期果實(shí)及葉片進(jìn)行果糖、葡萄糖和蔗糖3種糖的測定[22]。液相色譜儀（Waters e 2695，USA）測定條件為進(jìn)樣溫度35℃；流速1.0 mL?min-1；柱子（Previl Carbohydrate ES 5u）；蒸發(fā)光散射檢測器（Alltech ELSD2000ES）。

1.8 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit試劑盒（TIANGEN）試劑盒提取總RNA，采用PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連，中國）合成cDNA。根據(jù)的全長序列，利用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物（-F：5′-TG ATGCCTACATTCTCGCACC-3′和-R：5′-TCCTTTAGCCTCTCTTGCTGCC-3′；內(nèi)參引物Actin-F：5′-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3′和Actin-R：5′-AGTTAAATCACGACCAGCAAGA T-3′）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用TransStart Tip Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，北京，中國）試劑盒，儀器為BIO-RAD IQ5，使用TIANGEN生物公司的Super Real MasterMix（SYBR Green）試劑盒，反應(yīng)體系為2×SYBG Green Mix 9 μL、cDNA 2 μL、正向引物F1 μL和ddH2O 8 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，68℃15 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 SlSWEET7a的生物信息學(xué)分析

SlSWEET7a在NCBI中的蛋白編碼是LOC101246848，由254個(gè)氨基酸構(gòu)成，如圖1所示的SlSWEET7a蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域圖，圖中藍(lán)色線代表細(xì)胞質(zhì)定位，粉色線代表質(zhì)外體定位，紅色線段代表跨膜結(jié)構(gòu)域，從圖1可看出SlSWEET7a蛋白結(jié)構(gòu)是由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的，跨膜結(jié)構(gòu)域以外的區(qū)域較短。

將番茄與擬南芥SWEETs家族成員進(jìn)行同源性分析（圖2），可看出與—同源性較高，研究表明、和具有雙向葡萄糖運(yùn)輸能力，屬于CladeⅡ。的功能與—功能相似，可預(yù)測主要作為單糖轉(zhuǎn)運(yùn)體行使功能，可能在番茄的果實(shí)發(fā)育及成熟過程中發(fā)揮作用。

2.2 SlSWEET7a的組織特異性表達(dá)

提取番茄綠熟期、轉(zhuǎn)色期、紅熟期果實(shí)的果柄、萼片、果皮、中果肉、膠質(zhì)胎座、維管束、心室隔壁部位的RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后，以管家基因?yàn)閮?nèi)參基因，對(duì)其組織特異性表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測（圖3）。在綠熟期的果實(shí)維管束中的表達(dá)量最高，較對(duì)照明顯上調(diào)了3倍；果柄中的表達(dá)量也上調(diào)，其中在萼片中的表達(dá)量最低，其他部位的表達(dá)量顯著下調(diào)。轉(zhuǎn)色期果實(shí)在心室隔壁的表達(dá)量最低。紅熟期果實(shí)與轉(zhuǎn)色期的表達(dá)模式相似，其他組織的表達(dá)量都顯著低于根部，在果皮的表達(dá)量最低。

藍(lán)色線代表細(xì)胞質(zhì)定位，粉色線代表質(zhì)外體定位，紅色線段代表跨膜結(jié)構(gòu)域

……：SlSWEET7a所處進(jìn)化樹中位置，AtSWEET：擬南芥SWEET；SlSWEET：番茄SWEET

2.3 SlSWEET7a表達(dá)載體的獲得

2.3.1過表達(dá)全長的PCR擴(kuò)增及過表達(dá)載體檢測 根據(jù)已獲得的cDNA全長，設(shè)計(jì)過表達(dá)引物擴(kuò)增（圖4），獲得842 bp的目的片段，通過膠回收純化目的片段，純化產(chǎn)物經(jīng)測序得到的序列用NCBI軟件進(jìn)行Blast分析，與cDNA全長完全吻合。然后將測序匹配成功的產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和HⅠ進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定（圖4），含有目的片段的菌液進(jìn)行測序，鑒定成功的菌液提質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pBI121-35S-。構(gòu)建好的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，用于轉(zhuǎn)化番茄。

每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3次試驗(yàn)重復(fù)，采用Statistics 17.0軟件分析。*代表差異顯著性（p＜0.05）。下同

M：DNA Marker 10000；1：SlSWEET7a的PCR產(chǎn)物；2：過表達(dá)載體菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3.2 沉默全長的獲得及沉默載體檢測 根據(jù)已知序列全長，按照RNA干擾原理設(shè)計(jì)沉默引物，進(jìn)行沉默目的片段PCR擴(kuò)增（圖5-A）。采用Gateway技術(shù)構(gòu)建沉默載體，LR反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，菌液PCR驗(yàn)證正確（圖5-B）進(jìn)行測序，測序片段比對(duì)成功的菌液提取質(zhì)粒為pB7GWIWG2（Ⅰ）-35S-，進(jìn)行農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。

M：DNA Marker 2000；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：沉默載體菌液PCR產(chǎn)物

2.4 番茄SlSWEET7a超表達(dá)載體及沉默載體的瞬時(shí)表達(dá)分析

采用瞬時(shí)表達(dá)的方法對(duì)構(gòu)建的沉默及過表達(dá)載體的效率進(jìn)行初步探究，以未注射果實(shí)為CK、OE7a和S7a果實(shí)分別是注射了含有超表達(dá)載體pBI121-35S-和沉默載體pB7GWIWG2(I)- 35S-的農(nóng)桿菌菌液。注射3 d后提取注射果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA進(jìn)行qRT-PCR（圖6）。以未注射果實(shí)的相對(duì)表達(dá)水平為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)OE7a樣品果實(shí)中的表達(dá)量是未注射果實(shí)的6倍，其表達(dá)量明顯上調(diào)，S7a樣品果實(shí)中與CK相比明顯下調(diào)了5倍。綜上所述，構(gòu)建的沉默和過表達(dá)載體能夠引起在番茄果實(shí)中的表達(dá)變化，可用于進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.5 番茄轉(zhuǎn)基因材料的獲得和鑒定

過表達(dá)和沉默轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得（圖7），分別經(jīng)含有載體抗性基因和的培養(yǎng)基篩選，獲得10株可能的超表達(dá)植株，14株沉默植株。

對(duì)篩選出的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增出與陽性對(duì)照大小一致的目的片段（圖8-A和圖8-B），經(jīng)測序鑒定正確，而陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)化植株）未擴(kuò)增出任何條帶。初步確定目的基因已整合到番茄基因組中，獲得過表達(dá)植株8株，沉默植株10株。

CK：對(duì)照；OE7a：過表達(dá)植株；S7a：沉默植株。每組數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值

a：種子發(fā)芽；b：共培養(yǎng)；c：選擇培養(yǎng)/生芽培養(yǎng)；d：生根培養(yǎng)；e：煉苗；f：移栽

A：1：陽性對(duì)照，2：陰性對(duì)照，3：過表達(dá)植株；B：1：陰性對(duì)照，2：陽性對(duì)照，3：沉默植株。M：Marker

2.6 轉(zhuǎn)基因番茄T1代綠果期的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

前期試驗(yàn)結(jié)果表明番茄在果實(shí)綠熟期表達(dá)量最高。因此，對(duì)于獲得的T1轉(zhuǎn)基因植株分別提取綠熟期果實(shí)的總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（圖9）。以正常植株CK的表達(dá)量為對(duì)照，過表達(dá)植株7a-1、7a-2的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照，分別比對(duì)照下降13.78倍和4.05倍；沉默植株7a-3、7a-4、7a-5與對(duì)照相比表達(dá)量降低，分別降低4.64、1.20和2.21倍。進(jìn)一步驗(yàn)證了前面篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株是陽性植株，依據(jù)實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果，本研究獲得的過表達(dá)株系均發(fā)生了轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。

CK：對(duì)照，7a-1和7a-2為過表達(dá)植株；7a-3、7a-4和7a-5為沉默植株。每組數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值

2.7 T1代轉(zhuǎn)基因植株中糖的測定

植物成熟葉片作為“源”，其同化的光合產(chǎn)物除一部分用于自身代謝外，主要以蔗糖的形式通過韌皮部輸送到果實(shí)等庫組織中貯藏和利用。作為SWEETs家族CladeⅡ成員，主要參與單糖的運(yùn)輸。如表1所示，過表達(dá)植株7a-1和7a-2成熟葉片中果糖、葡萄糖和蔗糖含量較對(duì)照均升高；沉默植株7a-3、7a-4、7a-5葉片果糖含量提高1.1—9.2倍；7a-3和7a-5葡萄糖水平分別高于對(duì)照的9.2和1.1倍，而7a-5則無明顯變化；蔗糖含量均較WT提高2.5—11.7倍。而番茄作為肉質(zhì)果實(shí)，在果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，因此，果實(shí)中的糖濃度可以表現(xiàn)出SlSWEET7a參與糖轉(zhuǎn)運(yùn)的水平，由于在果實(shí)綠果期大量表達(dá)（圖3），測定綠熟期果實(shí)糖含量。在對(duì)照植株中（表1），綠果的果糖的含量為3.84 mg·g-1FW，過表達(dá)株系7a-1和7a-2的果糖含量較野生型高1.4和3.7倍，沉默植株7a-3和7a-5的果糖提高1.3和2.2倍，而7a-4沒有顯著改變；和果糖一樣，與WT相比，除了7a-4沉默株系無明顯變化，其他過表達(dá)和沉默植株的葡萄糖和蔗糖水平均顯著增加，分別升高了2.0—4.8倍和2.1—2.8倍。結(jié)果表明，過表達(dá)植株和沉默植株中果實(shí)和成熟葉片糖的變化趨勢一致，過表達(dá)植株發(fā)生了沉默現(xiàn)象，沉默能夠引起果實(shí)和成熟葉片果糖、葡萄糖和蔗糖的升高，特別是葉片中這三種糖的含量。

表1 T1代沉默和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株綠熟期果實(shí)和葉片的糖含量

CK：對(duì)照；7a-1和7a-2為過表達(dá)植株；7a-3、7a-4和7a-5為沉默植株；FW：鮮重；每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3次試驗(yàn)重復(fù)，采用Statistics 17.0軟件分析，不同字母代表差異顯著性

CK: Control; 7a-1 and 7a-2: overexpressing plants; 7a-3, 7a-4 and 7a-5: silencing plants; FW: Fresh weight; WT: Wild type. Data represent the mean±SE(n=3). Data are analyzed by SPSS Statistics 17.0. Means with different letters within a column indicate significant differences (least significant difference (＜0.05)

3 討論

研究表明擬南芥中SWEETs家族CladeⅡ的成員AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET7具有雙向葡萄糖運(yùn)輸能力，主要影響細(xì)胞中葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。本研究中番茄SlSWEET7a與擬南芥中SWEETs的生物信息學(xué)分析表明SlSWEET7a與AtSWEET4—AtSWEET8具有較高的同源性。擬南芥中相關(guān)CladeⅡ的大多都在花器官中表達(dá)，參與了花粉的發(fā)育。在花粉的營養(yǎng)細(xì)胞中特異性表達(dá)，尤其是在花粉成熟期高效表達(dá)，而在花粉發(fā)育時(shí)期能優(yōu)先表達(dá)[9,23]。，也被稱為，在植物花藥及花粉壁的發(fā)育時(shí)期發(fā)揮作用[24]。水稻中相關(guān)的在葉片和根莖部的生長區(qū)及萼片部位表達(dá)，對(duì)其頂端發(fā)育有著調(diào)控作用[25]。葡萄中的在其花中表達(dá)量最高，它的表達(dá)量隨著葡萄漿果的成熟也隨之升高[26]。本研究中番茄果實(shí)的時(shí)空表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)在番茄果實(shí)綠熟期高水平表達(dá)，說明其對(duì)果實(shí)發(fā)育起著調(diào)控作用，與其生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。從不同部位表達(dá)來看，在果實(shí)維管束和果柄表達(dá)量最高。果柄和果實(shí)維管束都屬于韌皮部疏導(dǎo)組織，在這兩個(gè)部位大量表達(dá)說明該基因有可能影響糖從源器官運(yùn)輸?shù)綆炱鞴俚囊谆瘮U(kuò)散。果實(shí)的轉(zhuǎn)色期和紅熟期，表達(dá)量都很低，可能是家族其他成員或其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮主要作用。

研究基因在植物中行使功能時(shí)常用到瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，將外源基因隨載體進(jìn)入目標(biāo)植物細(xì)胞中表達(dá)，2—3 d內(nèi)即可檢測出外源基因的高水平表達(dá)量，而且農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)是一種快速有效的分析基因表達(dá)的方法[27]。本研究通過對(duì)番茄果實(shí)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)處理，發(fā)現(xiàn)注射基因超表達(dá)及沉默載體的果實(shí)，其的表達(dá)量與未注射果實(shí)具有顯著性差異。含有過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌注射后導(dǎo)致綠熟期果實(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)；而含有沉默載體的農(nóng)桿菌注射果實(shí)后，表達(dá)量顯著下調(diào)，初步驗(yàn)證了所構(gòu)建載體能夠調(diào)控在番茄果實(shí)中的表達(dá)。在對(duì)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株的PCR檢測T1代轉(zhuǎn)基因番茄材料（圖9）發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)植株中表達(dá)量反而下降，顯著低于對(duì)照，這一結(jié)果是由于發(fā)生了轉(zhuǎn)基因的沉默現(xiàn)象。構(gòu)建的過表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的影響不同，這是由于瞬時(shí)表達(dá)過程中T-DNA并沒有轉(zhuǎn)化到基因組里，僅僅是短時(shí)期的在本代的一個(gè)階段表達(dá)，而穩(wěn)定表達(dá)通過載體的左右邊界，插入整合到植物基因組里，可以隨基因組分裂進(jìn)行遺傳。在這一過程中有可能受插入染色體位點(diǎn)、DNA甲基化及植物本身的調(diào)節(jié)機(jī)制影響[28]。由于在瞬時(shí)表達(dá)中檢測到高于對(duì)照果實(shí)的表達(dá)因此從沉默機(jī)制上，本研究中出現(xiàn)的過表達(dá)引起的轉(zhuǎn)基因沉默可能屬于轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。

目前，關(guān)于SWEET蛋白開展的研究結(jié)果顯示，它們在細(xì)胞與環(huán)境或細(xì)胞與細(xì)胞之間的糖類運(yùn)輸過程中有重要作用[4,7-8,29]。如AtSWEET1是濃度依賴型的具有雙向低親和運(yùn)輸葡萄糖的能力。AtSWEET11和AtSWEET12 則是蔗糖低親和的運(yùn)輸載體，在擬南芥葉片維管束細(xì)脈韌皮部薄壁細(xì)胞中表達(dá)，參與韌皮部薄壁細(xì)胞中蔗糖向質(zhì)外體的運(yùn)輸[7]。水稻OsSWEET11和OsSWEET14也是蔗糖低親和的運(yùn)輸載體, 它們也參與韌皮部蔗糖的裝載過程[4]。本研究對(duì)獲得的沉默T1代株系果實(shí)和葉片中糖含量的測定結(jié)果表明（表1），沉默后植株葉片和果實(shí)中果糖、葡萄糖和蔗糖含量高于對(duì)照，尤其是葉片中蔗糖含量顯著高于對(duì)照，說明SlSWEET7a可以轉(zhuǎn)運(yùn)果糖、葡萄糖和蔗糖。這一結(jié)果與水稻中OsSWEET11和OsSWEET14、擬南芥AtSWEET11和AtSWEET12也可以轉(zhuǎn)運(yùn)單糖和二糖的結(jié)論是一致的[7]。另外一些SWEET蛋白接收不同分子大小的底物，在糖易化功能方面SWEET基因家族成員之間存在冗余現(xiàn)象，而且對(duì)于一些依賴特定底物定位在質(zhì)膜上的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（monosaccharides transporter，MST）和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sucrose transporter，SUT/SUC）家族來說，它們的作用是未知的[30-31]，可能在SWEET7a的過表達(dá)和沉默之后，激活了這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和其他SWEET的活性，對(duì)糖的轉(zhuǎn)運(yùn)也發(fā)揮了作用，這需要進(jìn)一步進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。另外，SWEET7a在爪蟾卵母細(xì)胞中的功能是轉(zhuǎn)運(yùn)單糖葡萄糖，這可能在動(dòng)物和植物中其轉(zhuǎn)運(yùn)糖的表達(dá)方式不同[4,7]。

4 結(jié)論

SlSWEET7a與AtSWEET4—AtSWEET8具有較高的同源性，均屬于SWEETs蛋白家族CladeⅡ的成員，預(yù)測具有單糖的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。SlSWEET7a對(duì)糖從源器官運(yùn)輸?shù)綆炱鞴俚囊谆瘮U(kuò)散起作用。對(duì)葉片中蔗糖向源組織韌皮部的裝載及果實(shí)果柄、維管束的運(yùn)輸、卸載起重要調(diào)控作用。同時(shí)SWEET基因家族成員之間的糖易化功能存在冗余。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Functional Analysis ofGene during Maturation of Tomato Fruits

CHENG Jie, ZHANG XinSheng, LI AnQi, JIANG Jing

(CollegeofHorticulture，ShenyangAgriculturalUniversity/Key Laboratory of Protected Horticulture, Ministry of Education/Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province, Shenyang 110866)

【Objective】The SWEETs (Sugars Will Eventually Be Exported Transporters) is a kind of sugar transporters which are involved in plant biological processes and play key roles in plant growth and development in response to various stresses and host-pathogen interaction.was cloned and its function was analyzed to provide the theoretical foundation for exploring the function of SWEETs during fruit development in plant by constructing the silence and overexpression of.【Method】Using Micro-Tom () as a test material, the 842 bp full-lengthcDNA was cloned in fruits. The phylogenetic tree of SWEET proteins fromwas constructed by using MEGA6.0, and homology ofprotein sequences was analysed compared withRT-PCR was performed to analyse the spatiotemporal expression ofduring the fruits development periods. Thesilence vector and overexpression vector were constructed and transformed into tomato by-mediated genetic transformation. The efficiency of two vectors was examined by the transient expression ofs injection method. The expressions ofin T1generation transgenic green fruits were studied by quantitative PCR. The changes of sugar composition and content in transgenic fruits and leaves were detected by high performance liquid chromatography.【Result】The bioinformatics analysis of protein sequence showed that the SlSWEET7a is consisted of seven transmembrane domains. SlSWEET7a belongs to the CladeⅡof theSWEETs gene family, which was highly homologous to AtSWEET6 and AtSWEET8 ina. The analysis of spatiotemporal expression indicated thatexpression level was the highest at stalks and vascular bundles of mature green stage in tomato fruits, while the relative expression level was lower in breaker fruits and red ripping stage. The transient expression ofsilencing (S7a) and overexpression (OE7a) vector in tomato fruits was observed. The expression level ofin fruit of OE7a was 6 times higher than that of non-injected fruit, which was significantly up-regulated compared with control. However, the expression level ofin S7a was significantly decreased 5 times. Ten overexpression lines were obtained by kanamycin resistance screening, and eight overexpression lines were obtained by PCR. Fourteen silencing lines were screened by phosphinothricin and 10 transgenic silence lines were obtained by PCR. Real-time quantitative PCR analysis of theexpression in T1generation lines revealed that gene silencing occurred in overexpressed plants. The expression level of-overexpressing transgenic plants was significantly lower than that in wild plants, so did the silencing plants. Those results explained that the overexpressing plants also had the phenomenon of gene silencing. The determination of contents of fructose, glucose, sucrose showed that the silencing and overexpressing plants were higher than that of the wild type in the leaves and fruits after reducing expression ofin tomato. Especially, the sucrose content of leaves was significantly increased. This showed thatplays an important role in the facilitated diffusion of sucrose in cells.【Conclusion】plays an important role in regulating the loading of sucrose into the phloem of fruit tissue, the transportation and unloading of fruit stalks and vascular bundles.

tomato; SWEET7a; sugar transporter; vector construction; expression analysis

2018-01-23；

2018-03-06

國家自然科學(xué)基金（31372054）、沈陽市重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)（17-147-3-00）

程杰，Tel：15909820516；E-mail：904135901@qq.com。通信作者姜晶，Tel：13998229283；E-mail：jiangjingcau@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.0011