孫麗娜，田志強，張懷江，李艷艷，閆文濤，岳強，仇貴生

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氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的轉(zhuǎn)錄組分析

孫麗娜，田志強，張懷江，李艷艷，閆文濤，岳強，仇貴生

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，遼寧興城 125100）

【目的】探明氯蟲苯甲酰胺處理后桃小食心蟲（）成蟲的轉(zhuǎn)錄組差異，了解該藥劑影響桃小食心蟲交配的基因在功能分類和代謝通路等方面的生物學(xué)特征，挖掘與交配相關(guān)的功能基因。【方法】通過生物學(xué)實驗觀察氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲成蟲交配及繁殖情況。采用Illumina HiSeqTM2500高通量測序技術(shù)對剛羽化的桃小食心蟲雌雄成蟲、羽化后4—6 h進入交配高峰期的雌雄成蟲和經(jīng)氯蟲苯甲酰胺處理4—6 h的雌雄成蟲進行轉(zhuǎn)錄組測序，利用Trinity軟件對所得序列進行組裝及評估，之后對獲得的有效序列進行功能注釋，并利用qRT-PCR技術(shù)分析氯蟲苯甲酰胺處理后相關(guān)基因的時空表達(dá)變化。【結(jié)果】氯蟲苯甲酰胺處理后，桃小食心蟲的交配率顯著降低，壽命縮短，產(chǎn)卵量減少。通過合并組裝桃小食心蟲轉(zhuǎn)錄組有效序列共獲得102 831條unigene，其中34 526個有注釋信息。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，氯蟲苯甲酰胺處理過程中，雌雄蟲中分別有122個和147個基因發(fā)生變化，其中相同差異基因31個。對所存在的234個差異基因進行GO功能注釋和富集分析結(jié)果顯示，分子功能過程中的催化活性和結(jié)合活性及生物學(xué)過程中與代謝過程、單一生物體過程和細(xì)胞過程相關(guān)的5類基因占主導(dǎo)地位。KEGG分類結(jié)果顯示，富集到代謝通路的最多，有25個，包括昆蟲激素合成、藥物代謝等。通過比對分析，鑒定c64662.graph_c0為桃小食心蟲魚尼丁受體基因，其長度為15 637 bp，與已報道CsRyR的一致性為99.0%。此外，在234個差異基因中，鑒別羧酸酯酶unigene 3個、細(xì)胞色素P450 unigene 4個、肌鈣蛋白unigene 3個、氣味結(jié)合蛋白unigene 1個和生物鐘unigene 1個。細(xì)胞色素P450 c40709.graph_c0參與昆蟲激素生物合成。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中基因表達(dá)分析，12個基因在雌雄蟲中的表達(dá)均出現(xiàn)不同變化趨勢。qRT-PCR結(jié)果顯示，氯蟲苯甲酰胺誘導(dǎo)羧酸酯酶c51998.graph_c0基因上調(diào)表達(dá)；藥劑處理后，雌雄蟲的c57480.graph_c0和c53794.graph_c0的表達(dá)分別呈現(xiàn)顯著的上調(diào)和下調(diào)變化，而c40709.graph_c0基因僅在雄蟲中顯著下調(diào)，處理6 h后c53281.graph_c0只在雌蟲中上調(diào)表達(dá)；氯蟲苯甲酰胺處理后3個肌鈣蛋白基因在整個試驗階段均表現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢；雄蟲中的生物鐘unigene c60883.graph_c0和氣味結(jié)合蛋白unigene c45675.graph_c0的變化趨勢較為一致，進入暗期后立即上調(diào)，但均受氯蟲苯甲酰胺的抑制。雌蟲體內(nèi)RyR的表達(dá)量顯著上調(diào)，而雄蟲初次到達(dá)求偶高峰期前RyR的表達(dá)量與對照差異不顯著，到第2個求偶高峰期時，RyR表達(dá)顯著下調(diào)。除細(xì)胞色素P450 c57480.graph_c0、c40709.graph_c0和c53281.graph_c0外，其余基因在雄蟲中的表達(dá)均高于雌蟲。且觸角酯酶基因c54944.graph_c0、生物鐘基因c60883.graph_c0和氣味結(jié)合蛋白基因c45675.graph_c0在黑暗光照交替變化時，表達(dá)發(fā)生明顯地上調(diào)或下調(diào)?！窘Y(jié)論】通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)氯蟲苯甲酰胺干擾桃小交配的作用機制是由靶標(biāo)基因、嗅覺相關(guān)基因、代謝基因、生物鐘基因等相互作用引起的。

氯蟲苯甲酰胺；桃小食心蟲；交配；干擾；轉(zhuǎn)錄組

0 引言

【研究意義】桃小食心蟲（）又叫桃蛀果蛾，簡稱“桃小”，屬鱗翅目蛀果蛾科，我國除華南外，廣布于其他地區(qū)，是最主要的果實害蟲之一，寄主有蘋果、梨、桃、李、杏、梅、棗、山楂等果樹[1-2]。以幼蟲蛀食果實危害，蛀入果內(nèi)便很難進行藥劑防治，導(dǎo)致果實腐爛脫落。據(jù)統(tǒng)計，生產(chǎn)上若防治不當(dāng)，每年造成蟲果率高達(dá)75%以上，損失高達(dá)數(shù)十億元[3-4]。氯蟲苯甲酰胺2010年在中國登記并使用，基于氯蟲苯甲酰胺對天敵及非靶標(biāo)生物安全、殘留量低、對生態(tài)環(huán)境友好且與其他殺蟲劑無交互抗性的優(yōu)點，使其成為我國推廣應(yīng)用最早、使用量最大的防治大田作物和蔬菜害蟲的二酰胺類殺蟲劑，目前在防治桃小食心蟲上也開始逐漸使用[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)該類殺蟲劑除了對鱗翅目幼蟲具有高活性，還可以顯著干擾鱗翅目昆蟲的交配[8]，通過對氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的轉(zhuǎn)錄組分析，可以進一步解析其干擾桃小食心蟲的作用機制，進而提高藥劑的使用效率?！厩叭搜芯窟M展】近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)極大促進了昆蟲特別是無參考基因組信息昆蟲的組學(xué)研究，對闡明昆蟲對環(huán)境的適應(yīng)性、昆蟲生長、發(fā)育、繁殖、進化以及遺傳機制等均具有重要意義[9]。在昆蟲毒理學(xué)方向，國內(nèi)外學(xué)者通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究了昆蟲對殺蟲劑代謝、解毒及抗藥性機制等，涉及不同種類殺蟲劑如有機磷、菊酯類、二酰胺類、苯基吡唑類等，昆蟲有瘧蚊（）、蠅（）、灰飛虱（）、小菜蛾（）、玉米螟（）等[10-16]。Alfonso-Parra等分別通過轉(zhuǎn)錄組分析了埃及伊蚊（）和地中海實蠅（）在生長發(fā)育、交配繁殖中的變化[17-18]。氯蟲苯甲酰胺的靶標(biāo)基因為昆蟲魚尼丁受體（ryanodine receptor，RyR），通過調(diào)節(jié)鈣離子釋放，引起肌肉收縮，最終導(dǎo)致害蟲死亡[19]。桃小食心蟲的求偶交配行為具有節(jié)律性，成蟲多于下午16：00—20：00羽化，羽化當(dāng)日便可交配[20]。大量研究表明，雌性產(chǎn)生、釋放性激素和雄性接受性激素以及被吸引的行為都是由生物鐘控制的，生物鐘存在于嗅覺器官對嗅覺敏感的感受器基底上，嗅覺器官的化學(xué)受體在化學(xué)刺激的感知及識別過程中起了最重要的作用[21-24]。昆蟲的求偶交配行為由此類化學(xué)感知所介導(dǎo)，昆蟲在氣味結(jié)合蛋白（OBPs）與氣味受體相互作用中去尋求及選擇配偶?！颈狙芯壳腥朦c】然而，尚未見有關(guān)殺蟲劑干擾昆蟲交配的作用機制的報道。筆者通過藥效試驗發(fā)現(xiàn)，亞致死量氯蟲苯甲酰胺對桃小食心蟲交配具有明顯干擾作用，以此為切入點，桃小食心蟲經(jīng)藥劑處理后，通過靶標(biāo)基因、昆蟲交配節(jié)律基因及昆蟲嗅覺相關(guān)基因的變化來開展氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲的成蟲交配的作用機制研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以Illumina HiseqTM2500高通量測序技術(shù)對桃小食心蟲進行轉(zhuǎn)錄組測序研究，獲得桃小食心蟲的轉(zhuǎn)錄本和更為全面的轉(zhuǎn)錄組信息，揭示氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配過程中氯蟲苯甲酰胺、RyR、交配行為相關(guān)基因的相互作用。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所完成。

1.1 試蟲來源及飼養(yǎng)

供試蟲源采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所（遼寧興城，40.61°N，120.73°E），用未成熟不接觸任何殺蟲劑的金冠蘋果在室溫（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，光周期L﹕D=15﹕9的條件下連續(xù)繼代飼養(yǎng)備用。

1.2 氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的生物學(xué)測定

用微型噴霧器將1 mL 10 mg·L-1氯蟲苯甲酰胺（原藥由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所饋贈）藥液（0.5‰的曲拉通為溶劑）均勻噴灑在每個養(yǎng)蟲缸（直徑13 cm，高15 cm）內(nèi)壁及蓋子，待養(yǎng)蟲缸內(nèi)壁及蓋子干燥后，每缸引入剛羽化的桃小食心蟲雌雄蟲5對；以0.5%的曲拉通溶液為空白對照。每缸引入成蟲后置于黑暗環(huán)境（進入黑暗環(huán)境4—6 h進入交尾高峰期[20]）。自進入黑暗環(huán)境2 h后，在0.3 lx的紅光燈下觀察7 h，記錄交配情況、壽命及雌蟲產(chǎn)卵量和孵化率[3]。每30對為1次重復(fù)，各處理3次重復(fù)。

用于轉(zhuǎn)錄組測序的桃小食心蟲處理方法同上，每重復(fù)15—20缸，取樣分為6組：剛羽化的雌雄蟲分別為T1和T2組；羽化后進入黑暗環(huán)境4—6 h到達(dá)交配高峰期的雌雄蟲分別為T3和T4組；羽化后置于10 mg·L-1氯蟲苯甲酰胺環(huán)境并進入黑暗4—6 h的雌雄蟲分別為T5和T6組。每處理取蟲20—30頭，每處理3次重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱以備RNA提取。

1.3 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和Illumina測序

用TRIzol試劑（Invitrogen）分別提取18組凍存的桃小食心蟲總RNA，質(zhì)量檢驗合格后備用。cDNA文庫的建立及測序工作由百邁客有限公司（北京）完成，采用Illumina HiSeq2500TM系統(tǒng)進行測序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)組裝及分析

測序完成后獲得原始reads，于http://www. biocloud.net/進行無參轉(zhuǎn)錄組分析。采用Trinity v2.3.0軟件首先將測序reads打斷為較短的片段（K-mer），然后將這些小片段延伸成較長的片段（contig），并利用這些片段之間的重疊，得到片段集合（component），最后利用De Bruijn圖的方法和測序read信息，在各個片段集合中分別識別轉(zhuǎn)錄本序列，拼接得到的序列稱之為unigene。使用Blast2go軟件將拼接的unigene與NCBI的NR（非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫）、Swiss-Prot（蛋白質(zhì)注釋信息數(shù)據(jù)庫）、GO（Gene Ontology）、COG（Clusters of Orthologous Groups）、KOG（euKaryotic Orthologous Groups）、KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫比對。使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果，預(yù)測完unigene的氨基酸序列之后使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得unigene的注釋信息。采用Bowtie將測序得到的reads與unigene庫進行比對，根據(jù)比對結(jié)果，結(jié)合RSEM進行表達(dá)量水平估計，利用FPKM（fragments per kilobase per million reads）值表示對應(yīng)unigene的表達(dá)豐度。根據(jù)試驗設(shè)計，使用EBSeq進行差異表達(dá)分析，將FDR（false discovery rate）＜0.05且差異倍數(shù)FC（fold change）≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得兩個樣品之間的差異表達(dá)基因集[25]。并對差異基因進行GO功能富集和KEGG代謝通路信息分析。

1.5 氯蟲苯甲酰胺靶標(biāo)基因RyR、桃小食心蟲轉(zhuǎn)錄組差異基因的鑒定及表達(dá)分析

根據(jù)1.2的設(shè)計方法，分別分析藥劑處理前后雌蟲（比較T1與T3、T1與T5、T3與T5的差異，分別為I、III、V）和雄蟲（比較T2與T4、T2與T6、T4與T6的差異，分別為II、IV、VI）及藥劑導(dǎo)致的雌雄蟲的所有差異基因。篩選與解毒代謝酶羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的基因，以及與昆蟲交配及生物鐘相關(guān)的基因。根據(jù)已報道的桃小食心蟲魚尼丁受體基因序列（GenBank登錄號：KJ135037）進行比對，鑒別本研究轉(zhuǎn)錄組中的RyR基因，并根據(jù)功能注釋鑒別差異基因中與肌肉收縮相關(guān)的其他蛋白。

按照1.2的處理方法，分別提取桃小食心蟲0 h（剛羽化）、2、4、6、8、12和28 h（未交配的成蟲第2次進入求偶交配高峰期）成蟲的總RNA，分別取500 ng RNA合成cDNA第一鏈（Takara，大連）。每樣品重復(fù)3次，以18S作為內(nèi)標(biāo)參比基因，各基因引物見表1。試驗于CFX96 Real-Time System（BioRad）儀上進行，反應(yīng)體系為25 μL：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（TliRNaseH Plus）12.5 μL，10 μmol·L-1正反向各引物0.4 μL，1 μL稀釋10倍的cDNA，ddH2O 10.7 μL。反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，45個循環(huán)。用2-ΔΔCt法統(tǒng)計所篩選基因在氯蟲苯甲酰胺處理后不同時間的表達(dá)量差異[26]。

2 結(jié)果

2.1 氯蟲苯甲酰胺對桃小食心蟲交配、壽命及繁殖的影響

由表2可知，10 mg·L-1氯蟲苯甲酰胺處理桃小食心蟲后，交配率降低43.4%，雌雄蟲壽命分別縮短1.5 d和1.7 d，單雌產(chǎn)卵量與對照相比減少133粒，后代卵的孵化率由84.3%降至56.6%?？梢姡认x苯甲酰胺對桃小食心蟲的交配率、壽命、單雌產(chǎn)卵量和后代卵的孵化率均產(chǎn)生抑制作用。

表1 qRT-PCR基因及引物

表2 氯蟲苯甲酰胺對桃小食心蟲交配、壽命及繁殖的影響

交配率、后代孵化率采用卡方檢驗；單雌產(chǎn)卵量用檢驗；壽命用單因素方差Duncan分析，＜0.05為差異顯著

Mating rate and egg hatchability are analyzed by Chi-Square test; number of eggs laid per female is analyzed by-test; the longevity is analyzed by Duncan and＜0.05 indicate significant difference

2.2 桃小食心蟲轉(zhuǎn)錄組組裝

氯蟲苯甲酰胺處理組和對照組桃小食心蟲成蟲的18個轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，原始數(shù)據(jù)（NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，登錄號：SRP143636）去除其中的接頭序列、污染序列及低質(zhì)量reads，共得到147.64 Gb Clean Data （NCBI TSA數(shù)據(jù)庫，登錄號：GGMY00000000），各樣品Q30堿基百分比均≥88.43%。最終對所得Clean Data進行拼接共得到225 969條transcript和102 831條unigene，transcript與unigene的N50分別為2 744和1 378 bp，transcript與unigene的平均長度分別為1 408和704 bp。表3所示，長度＞1 000 bp的unigene有16 421條，占全部unigene的15.97%?？梢?，本研究中18組轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的組裝完整性較高，組裝結(jié)果和統(tǒng)計結(jié)果表明能夠進行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表3 桃小食心蟲轉(zhuǎn)錄組測序組裝結(jié)果統(tǒng)計

2.3 功能注釋及序列特征

將組裝得到的102 831個unigene序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG和Pfam數(shù)據(jù)庫比對，通過選擇BLAST參數(shù)E-value≤1e-5和HMMER參數(shù)E-value≤1e-10，最終獲得34 526個有注釋信息的unigene（表4），占總unigene數(shù)的33.58%。由表4可以明確看出，eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋成功的unigene數(shù)量最多，占總unigene數(shù)的31.70%，其后依次是NR、Pfam、KOG、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG，分別占總unigene數(shù)的24.31%、22.33%、20.52%、14.52%、13.39%、11.92%和11.50%。根據(jù)序列同源性比對，在NR數(shù)據(jù)庫中，與家蠶（）和帝王蝶（）同源的基因較多，分別為6 221個和4 814個。

2.4 氯蟲苯甲酰胺影響桃小交配的差異基因及功能注釋

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，兩兩比較藥劑對雌雄蟲的差異基因，結(jié)果如圖1所示。分析發(fā)現(xiàn)，氯蟲苯甲酰胺處理過程中，雌雄蟲中分別有122個和147個基因發(fā)生變化，共有234個基因發(fā)生變化，同時在雌雄體內(nèi)存在的有31個差異基因。

對氯蟲苯甲酰胺干擾桃小交配的所有差異基因進行功能注釋和富集分析，GO分類結(jié)果如圖2所示，共將其分為3大類，分別是分子功能（molecular function）、細(xì)胞組分（cellular component）和生物學(xué)過程（biological process），主要描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能，以及所處的細(xì)胞環(huán)境和參與的生物學(xué)過程，分別分8小類、8小類和14小類。其中分子功能過程中的催化活性和結(jié)合及生物學(xué)過程中的代謝過程、單一生物體過程和細(xì)胞過程5類占主導(dǎo)地位。

表4 Unigene注釋統(tǒng)計表

表中數(shù)據(jù)均為相應(yīng)unigene數(shù)目 Data in the table are corresponding unigene numbers

I：T1與T3相比存在的差異基因Different unigenes between T1 & T3；III：T1與T5相比存在的差異基因Different unigenes between T1 & T5；V：T3與T5相比存在的差異基因Different unigenes between T3 & T5；II：T2與T4相比存在的差異基因Different unigenes between T2 & T4；IV：T2與T6相比存在的差異基因Different unigenes between T2 & T6；VI：T4與T6相比存在的差異基因Different unigenes between T4 & T6；F：雌蟲間的差異基因Different genes in female；M：雄蟲間的差異基因Different genes in male

KEGG分類結(jié)果顯示，富集到30個KEGG途徑，其中富集到代謝通路的最多，有25個，分別為嘌呤代謝、酪氨酸代謝、磷酸戊糖途徑、碳代謝、氨基酸生物合成、氨糖和核糖代謝、賴氨酸降解、昆蟲激素合成、藥物代謝、脂肪酸合成、代謝及降解等；遺傳信息過程的剪接體、環(huán)境信息過程的MAPK信號途徑-飛行Jak-STAT信號途徑、FOXO信號途徑和細(xì)胞過程的內(nèi)噬作用。

2.5 RyR基因及差異基因的鑒定

經(jīng)過BLASTx分析，鑒定轉(zhuǎn)錄組中c64662. graph_c0為桃小食心蟲RyR，其長度為15 637 bp，與已報道桃小食心蟲CsRyR的一致性為99.0%。根據(jù)Pfam、Swissprot和NR數(shù)據(jù)庫的功能注釋，分別鑒定到羧酸酯酶unigene 3個（c51998.graph_c0、c64262. graph_c0、c54944.graph_c0）、細(xì)胞色素P450 unigene 4個（c57480.graph_c0、c53794.graph_c0、c40709. graph_c0、c53281.graph_c0）、肌鈣蛋白unigene 3個（c47942.graph_c0、c12249.graph_c0、c46002. graph_c0）、氣味結(jié)合蛋白unigene 1個（c45675. graph_c0）和生物鐘unigene 1個（c60883.graph_c0）。并且根據(jù)KEGG代謝途徑分析，c40709.graph_c0為昆蟲激素生物合成途徑中的重要基因。

2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

據(jù)轉(zhuǎn)錄組中的count及FPKM值分析，羽化后4—6 h，雌蟲有17個基因上調(diào)，9個下調(diào)；雄蟲有16個上調(diào)，12個下調(diào)。但氯蟲苯甲酰胺處理組與剛羽化的處女蛾相比，雌雄蟲上調(diào)基因分別為33個和32個，下調(diào)基因為69個和82個。然而，與4—6 h的對照比，雌蟲中16個基因上調(diào)，5個下調(diào)，而雄蟲中只存在20個下調(diào)基因。根據(jù)2.5中靶基因和差異基因鑒定，分析氯蟲苯甲酰胺處理前后，13個基因的表達(dá)變化，如圖3所示，基因在雌雄蟲中的表達(dá)均出現(xiàn)不同變化趨勢。

M1：催化活性catalytic activity；M2：結(jié)合binding；M3：運輸活性transporter activity；M4：結(jié)構(gòu)分子活性structural molecule activity；M5：電子載體electron carrier activity；M6：受體活性receptor activity；M7：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子nucleic acid binding transcription factor activity；M8：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性molecular transducer activity；C1：細(xì)胞cell；C2：細(xì)胞組分cell part；C3：膜membrane；C4：細(xì)胞器organelle；C5：膜部分membrane part；C6：細(xì)胞外區(qū)域extracellular region；C7：細(xì)胞外區(qū)域部分organelle part；C8：高分子復(fù)合物macromolecular complex；B1：代謝過程metabolic process；B2：單一生物體過程single-organism process；B3：細(xì)胞過程cellular process；B4：定位localization；B5：多細(xì)胞器進程multicellular organismal process；B6：生長過程developmental process；B7：生物調(diào)控biological regulation；B8：刺激響應(yīng)response to stimulus；B9：細(xì)胞組分及起源cellular component organization or biogenesis；B10：繁殖reproduction；B11：信號signaling；B12：復(fù)制reproductive process；B13：多有機體過程multi-organism process；B14：移動locomotion

圖3 靶基因和差異基因表達(dá)熱圖

qRT-PCR結(jié)果顯示，氯蟲苯甲酰胺處理過程中，12個差異基因及靶標(biāo)基因RyR均表現(xiàn)不同的變化趨勢（圖4）。3個羧酸酯酶家族基因雄蟲中的表達(dá)量均顯著高于雌蟲，且氯蟲苯甲酰胺誘導(dǎo)c51998.graph_c0基因上調(diào)，對雄蟲c64262.graph_c0的表達(dá)變化不明顯，雌蟲中c64262.graph_c0略有下調(diào)。進入暗期后，氯蟲苯甲酰胺顯著地刺激c54944.graph_c0下調(diào)。氯蟲苯甲酰胺對桃小食心蟲成蟲細(xì)胞色素P450 unigene未表現(xiàn)出相同的作用趨勢，藥劑處理后，雌雄蟲的c57480.graph_c0和c53794.graph_c0表達(dá)分別呈現(xiàn)顯著的上調(diào)和下調(diào)變化，而c40709.graph_c0基因僅在雄蟲中顯著下調(diào)，處理6 h后c53281.graph_c0只在雌蟲中表達(dá)上調(diào)。氯蟲苯甲酰胺處理后3個肌鈣蛋白基因（c47942.graph_c0、c12249.graph_c0、c46002.graph_c0）在整個試驗階段均表現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢，且雄蟲中的表達(dá)也高于雌蟲。經(jīng)過暗期進入光照時即12 h時，c54944.graph_c0的表達(dá)由暗期的下調(diào)轉(zhuǎn)為上調(diào)，雄蟲中的生物鐘基因c60883.graph_c0在交替環(huán)境下也發(fā)生了相似的變化。并且雄蟲中的c60883.graph_c0表達(dá)量是雌蟲的2.58倍。同樣氣味結(jié)合蛋白unigene c45675.graph_c0雄蟲中的表達(dá)是雌蟲的6.07倍，雌蟲體內(nèi)該基因表達(dá)較為穩(wěn)定，而進入暗期后該基因在雄蟲體內(nèi)立即上調(diào)，從黑暗轉(zhuǎn)至光照環(huán)境后，表達(dá)則迅速下調(diào)，再進入暗期其表達(dá)仍上調(diào)，但受氯蟲苯甲酰胺的抑制。

柱狀圖：對照；折線：氯蟲苯甲酰胺處理 Histogram: control blank; Line chart: treatment with chlorantraniliprole

3 討論

3.1 桃小食心蟲響應(yīng)氯蟲苯甲酰胺的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的GO富集

通過GO功能注釋，桃小食心蟲到達(dá)求偶高峰期時所有差異表達(dá)基因主要富集至催化活性、結(jié)合、代謝過程、單一生物體過程和細(xì)胞過程。崔麗[27]研究發(fā)現(xiàn)二酰胺藥劑氟苯蟲酰胺處理玉米螟幼蟲后，信號基因略有增加，與結(jié)構(gòu)分子活性及蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)的基因數(shù)量減少。小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺種群轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果顯示主要富集至結(jié)合、催化活性、細(xì)胞組分、細(xì)胞、代謝過程和細(xì)胞過程等[12]。煙粉虱抗噻蟲嗪種群轉(zhuǎn)錄組GO富集與小菜蛾極為相似[28]。Shi等[29]研究表明，亞致死濃度噻蟲嗪使蜜蜂轉(zhuǎn)錄組基因主要富集至細(xì)胞組分、生物學(xué)過程和代謝過程。蠕蟲對有機磷殺蟲劑抗性品系中，雌雄轉(zhuǎn)錄組在GO功能注釋也與其他研究相似[30]。昆蟲發(fā)育過程研究發(fā)現(xiàn)，未成熟的地中海實蠅雌蠅unigene GO功能富集于生物學(xué)過程的發(fā)育、生長調(diào)節(jié)、形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和激活、對刺激物的響應(yīng)、運動、卵形成和免疫效應(yīng)過程，而打破成熟期時富集于脂肪、糖及氨基酸的代謝過程、激素及信息素的合成與調(diào)控、以及對化學(xué)刺激的感知[18]。雄蠅則從免疫效應(yīng)響應(yīng)、肌肉收縮和飛行行為的過程轉(zhuǎn)至富集到以代謝和生物合成過程，如激素及信息素的合成與調(diào)控、免疫響應(yīng)過程為主[18]。桃小食心蟲求偶交配時，首先雄蟲通過短距離飛翔或者迅速爬行來引誘雌蟲，而后活動減少，雌蟲開始短距離飛行振翅后靜止，翹翅，尾端向上。此時雄蟲再次飛行，尋找翹翅的雌蟲即成一字型交配[20]?？梢娗笈冀慌湫袨榕c桃小食心蟲雌雄成蟲轉(zhuǎn)錄組基因富集的GO功能差異存在必然聯(lián)系，氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的作用機制或許更為復(fù)雜，還有待深入研究。

3.2 桃小食心蟲響應(yīng)氯蟲苯甲酰胺的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的KEGG富集

Lin等[12]研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾與氯蟲苯甲酰胺抗性相關(guān)的KEGG通路主要為嘌呤代謝、肌肉收縮、藥物代謝、Ca2+信號通路、細(xì)胞色素p450代謝等。本研究盡管未發(fā)現(xiàn)與Ca2+信號及肌肉收縮相關(guān)的途徑，但發(fā)現(xiàn)了可以調(diào)節(jié)肌肉收縮的肌動蛋白?？赡苡捎谔幚頃r間較短、桃小食心蟲接觸到的藥劑較少引起。此外，在其余差異基因中，參與KEGG途徑最多的為嘌呤代謝，有研究發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝與能量代謝也存在直接關(guān)系，并有研究表明昆蟲飛行過程中能量代謝最活躍的組織是飛行肌[31]。而氯蟲苯甲酰胺作用于昆蟲RyR，Ca2+濃度升高，繼而引起肌肉的收縮反應(yīng)[32]。故氯蟲苯甲酰胺處理后，桃小食心蟲成蟲的飛行肌收縮，飛行能量降低，導(dǎo)致求偶行為受阻。

基于KEGG數(shù)據(jù)庫進一步了解氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的相關(guān)基因的功能聯(lián)系及其參與的生物學(xué)通路，分析發(fā)現(xiàn)12個差異基因中，1個富集到了昆蟲激素生物合成途徑，該基因為細(xì)胞色素P450 c40709.graph_c0，是蛻皮激素20E生物合成過程中相關(guān)的5個Halloween基因之一，為調(diào)控蛻皮激素合成的最后一個基因[33-34]。研究發(fā)現(xiàn)，球菜夜蛾（）20E可影響雄蟲對雌蟲所發(fā)出的性信息素的應(yīng)答，增加或減少交配行為[35]。故推測氯蟲苯甲酰胺導(dǎo)致c40709.graph_c0的表達(dá)量下調(diào)致使雄蟲對雌蟲的性信息素應(yīng)答行為減弱，干擾其交配。

3.3 氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配中差異基因表達(dá)分析

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，氯蟲苯甲酰胺處理小菜蛾幼蟲和甜菜夜蛾細(xì)胞后，RyR表達(dá)量上調(diào)；而小菜蛾和甜菜夜蛾細(xì)胞由氯蟲苯甲酰胺環(huán)境轉(zhuǎn)至無藥環(huán)境后，RyR表達(dá)量又降低[36-37]。與之不同的是，經(jīng)氯蟲苯甲酰胺處理后，雌蟲中RyR的表達(dá)量顯著上調(diào)，而雄蟲中在第一個黑暗期的表達(dá)量變化不明顯，再經(jīng)歷第一個交配高峰期后，氯蟲苯甲酰胺處理的雄蟲RyR表達(dá)量顯著下調(diào)。Lin等[12]通過分析對氯蟲苯甲酰胺具有抗性的小菜蛾轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，RyR表達(dá)量降低。二酰胺類化合物NK130102和氟苯蟲酰胺導(dǎo)致亞洲玉米螟魚尼丁受體基因的表達(dá)量分別上調(diào)3.7和4.2倍。并發(fā)現(xiàn)鈣信號通路中的部分基因以及與肌肉收縮相關(guān)的一些基因（如Ca2+ATPase、肌球蛋白、肌動蛋白、M-線蛋白等）的表達(dá)量也明顯上調(diào)2.5—30倍[27]。與本研究略有差異，本研究發(fā)現(xiàn)3個與肌肉收縮相關(guān)的肌鈣蛋白表達(dá)量均下調(diào)。氯蟲苯甲酰胺處理后，基因在相同的時間表現(xiàn)不同的變化趨勢，可能與昆蟲求偶交配的高峰期持續(xù)時間不同有關(guān)。

timeless為生物鐘基因之一，桃小食心蟲的求偶交配行為具有明顯的晝夜節(jié)律。美國俄勒岡州立大學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲因其生物鐘使其在一天的特定時間對農(nóng)藥更具易感性[38]。本研究結(jié)果表明，氯蟲苯甲酰胺處理后雄蟲的timeless基因下調(diào)是該類藥劑干擾桃小食心蟲交配的影響因素之一。殺蟲劑對昆蟲的作用機制研究中，大多研究發(fā)現(xiàn)抗性品系中或者亞致死劑量脅迫后，昆蟲解毒酶、代謝酶如CYP、CCE和GST的表達(dá)上調(diào)，CSPs、卵黃蛋白、防御素等表達(dá)下調(diào)[10-15,23-25,39]。經(jīng)氯蟲苯甲酰胺脅迫的桃小食心蟲雄蟲觸角酯酶c54944.graph_c0基因和氣味結(jié)合蛋白c45675.graph_c0均發(fā)生相同變化。而昆蟲的任何一種生理現(xiàn)象，都由多個基因或者各個信號通路之間互作才能完成。氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲的交配，RyR、CYP314A1、OBP、timeless等基因是如何相互作用的？要闡明此機制，還需更深入的研究。

4 結(jié)論

通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的作用機制是由靶標(biāo)基因、嗅覺相關(guān)基因、代謝基因、生物鐘基因等相互作用引起的，然而仍需增加這些基因的功能及互作研究才可進一步探析氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的作用機制。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Transcriptome Analysis of Disruption of Mating in the Peach Fruit Moth () by Chlorantraniliprole

SUN LiNa, TIAN ZhiQiang, ZHANG HuaiJiang, LI YanYan, YAN WenTao, YUE Qiang, QIU GuiSheng

(Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】 The objective of this study is to identify the difference of transcriptome of peach fruit moth () adults under the stress of chlorantraniliprole, and describe biological characteristics involved in functional classifications and metabolic pathways, which is necessary to understand functional genes for mating. 【Method】Biological experiments were carried out to observe the effects of chlorantraniliprole on mating and reproduction of. The high throughput sequencing platform Illumina HiSeqTM2500 was used to sequence the transcriptome ofadults (including virgin female and male, female and male with courtship behavior in the mating season after emergence for 4-6 h, female and male exposed to chlorantraniliprole for 4-6 h).assembling and assessment were carried out by Trinity software, and then the effective sequential data were assigned to the relevant databases to perform functional annotation analysis. The temporal and spatial expression level of the related genes ofwas analyzed by qRT-PCR after chlorantraniliprole treatment.【Result】After chlorantraniliprole treatment, the mating rate, adult longevity and fertility ofdecreased. 102 831 unigenes were assembled from the transcriptomes, and 34 526 unigenes were annotated. According to the screening criteria, in the process of chlorantraniliprole treatment, 122 differentially expressed genes (DEGs) and 147 DEGs were identified in female and male adults, respectively, of which 31 DEGs were co-existed. The results of gene ontology (GO) functional annotation and enrichment analysis of 234 DEGs showed that these genes were annotated into 5 dominated process, including catalytic activity and binding activity in the molecular functional process, metabolic process, single-organism process and cellular process in the biological process. By KEGG pathways identification, 234 DEGs were enriched in 25 pathways for metabolic, which included insect hormone biosynthesis, drug metabolism, etc. The c64662.graph_c0 was identified as ryanodine receptor fromby BLAST, its length is 15 637 bp and it has 99.0% identity with the reportedCsRyR. Furthermore, 3 carboxylesterase unigenes, 4 cytochrome P450 unigenes, 3 troponin unigenes, 1 odorant binding protein unigene and 1 timeless unigene were annotated. The P450 c40709.graph_c0 is involved in insect hormone biosynthesis. Gene expression levels of 12 DEGs based on the FPKM value showed different trends. Finally, qRT-PCR was used to identify the 12 DEGs and RyR. The expression of carboxylesterase c51998.graph_c0 gene fromadult was up-regulated after treated with chlorantraniliprole. The expression of cytochrome P450 c57480.graph_c0 and c53794.graph_c0 fromfemale and male adults was significantly up-regulated and down-regulated, respectively, while the expression of cytochrome P450 c40709. graph_c0 gene was significantly down-regulated only in males, the expression of cytochrome P450 c53281.graph_c0 gene was up-regulated only in females after 6 h treatment. The expression of three troponin genes was significantly down-regulated during the whole trial period. The circadian clock unigene c60883.graph_c0 and odor binding protein unigene c45675.graph_c0 showed the same variation trend, which were up-regulated immediately after dark period, but were inhibited by chlorantraniliprole. The expression of RyR was significantly up-regulated in females, but there was no significant difference between male and control before the first courtship peak, and the expression of RyR was down-regulated significantly at the second courtship peak. The expression of other unigenes in the males was higher than that of the females except cytochrome P450s c57480.graph_c0, c40709.graph_c0 and c53281.graph_c0. Moreover, the expression of antennal esterase gene c54944.graph_c0, clock gene c60883.graph_c0 and odor binding protein gene c45675.graph_c0 was significantly up- or down- regulated when the dark/light changed alternately.【Conclusion】By transcriptome sequencing, it was found that the mechanism of disruption of mating inby chlorantraniliprole was possibly coursed by the interaction of target gene, olfactory related gene, metabolic gene, circadian clock gene and so on.

chlorantraniliprole;; mating; disruption; transcriptome

2018-02-06；

2018-04-19

國家自然科學(xué)基金（31601643）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610182016004）

孫麗娜，E-mail：sunlina@caas.cn。通信作者仇貴生，Tel：0429-3598266；E-mail：guoshu2008@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.008