劉海璐，王暄，李紅梅，李艷霞，薛博文，馬居奎

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我國(guó)黃淮麥區(qū)10個(gè)短體線蟲樣品種類的分子鑒定

劉海璐，王暄，李紅梅，李艷霞，薛博文，馬居奎

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

【目的】短體線蟲（spp.）是植物根系內(nèi)遷移性寄生線蟲，可引起許多作物的根腐線蟲病，給世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了極大的危害。為明確我國(guó)黃淮麥區(qū)與禾谷孢囊線蟲復(fù)合侵染小麥的短體線蟲種類，本研究對(duì)采自黃淮4省麥區(qū)的10個(gè)短體線蟲樣品進(jìn)行種類的分子鑒定，分析種群系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及種內(nèi)遺傳變異，以期為我國(guó)小麥根部線蟲病害的綜合防治提供指導(dǎo)。【方法】對(duì)采自江蘇、安徽、河南和山東4省小麥孢囊線蟲發(fā)病田中的10個(gè)小麥短體線蟲樣品進(jìn)行線蟲分離，從各樣品中隨機(jī)挑取5條短體線蟲，分別提取單條線蟲DNA，擴(kuò)增rDNA 18S片段并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，選取序列有代表性的2個(gè)DNA樣本進(jìn)一步擴(kuò)增其rDNA 28S D2-D3區(qū)以及mtDNA-COI基因片段，經(jīng)序列比對(duì)分析后，利用MEGA4.0軟件采用鄰接法分別構(gòu)建基于rDNA 18S、28S D2-D3和mtDNA-COI序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過(guò)聚類關(guān)系及相似度分析確定線蟲種類，同時(shí)利用種特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證。【結(jié)果】擴(kuò)增挑取的50條短體線蟲的rDNA 18S區(qū)片段，測(cè)序得到片段長(zhǎng)度在857—935 bp，BLAST比對(duì)分析揭示部分樣品可能為短體線蟲的混合種群；進(jìn)一步測(cè)定的20個(gè)代表性DNA樣本的rDNA 28S D2-D3區(qū)和mtDNA-COI基因的片段長(zhǎng)度分別在771—784 bp和415—417 bp；系統(tǒng)進(jìn)化樹以及相似度分析揭示我國(guó)黃淮流域4省麥區(qū)10個(gè)短體線蟲樣品中有咖啡短體線蟲（e）、落選短體線蟲（）和斯克里布納短體線蟲（），其中，江蘇沛縣樣品JS2和山東濰坊樣品SD1是落選短體線蟲單一侵染樣品，河南永城樣品HN2和安徽淮北樣品AH3是咖啡短體線蟲單一侵染樣品，安徽蕭縣樣品AH2、AH5和淮北樣品AH4以及河南永城樣品HN1和HN3均為落選短體線蟲和咖啡短體線蟲的混合侵染樣品，江蘇徐州樣品JS1是落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲的混合侵染樣品。用SCAR特異性引物擴(kuò)增20個(gè)短體線蟲單條DNA樣本，結(jié)果顯示，用落選短體線蟲特異性引物PNEG-F1/D3B5能夠從JS1-2、JS2-1、JS2-2、AH2-2、AH4-1、AH5-1、HN1-2、HN3-2、SD1-1和SD1-2等10個(gè)樣本中擴(kuò)增出140 bp的單一條帶，用咖啡短體線蟲引物PC1/PC2能夠從AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2、AH5-2、HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1等9個(gè)樣本中擴(kuò)增出630 bp的單一條帶，用斯克里布納短體線蟲引物PsF7/PsR7從JS1-1中擴(kuò)增出130 bp的單一條帶，種類鑒定結(jié)果與上述序列分析結(jié)果相一致?！窘Y(jié)論】我國(guó)黃淮流域4省小麥孢囊線蟲發(fā)病田中的短體線蟲種類有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲，其中落選短體線蟲是優(yōu)勢(shì)種，證實(shí)了短體線蟲不同種群復(fù)合侵染小麥的現(xiàn)象較為普遍?；趍tDNA-COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以有效區(qū)分短體線蟲的近緣種，相比rDNA 18S和28S基因更適于作為短體線蟲種類鑒定的分子靶標(biāo)。

短體線蟲；種類鑒定；rDNA；mtDNA；系統(tǒng)進(jìn)化；SCAR

0 引言

【研究意義】短體線蟲（Pratylenchusspp.）是一類分布廣泛、寄主眾多的遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，可侵染植物根部組織，導(dǎo)致根系表皮破裂、塊莖內(nèi)部腐爛等；此外，短體線蟲造成的根部傷口可為植物病原真菌和細(xì)菌侵入提供有利條件，誘發(fā)復(fù)合侵染，引起作物減產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降[1-2]。目前短體線蟲屬有效種已達(dá)101個(gè)[3-4]，我國(guó)已報(bào)道的短體線蟲有20多種，危害的作物種類包括小麥、玉米、大豆、花生、棉花、苧麻、馬鈴薯、山藥、草莓、石榴、煙草等[5]。筆者實(shí)驗(yàn)室在調(diào)查我國(guó)黃淮麥區(qū)孢囊線蟲發(fā)生分布過(guò)程中[6-7]，發(fā)現(xiàn)短體線蟲與孢囊線蟲復(fù)合侵染小麥根系的現(xiàn)象普遍存在，這種復(fù)合侵染對(duì)于抗線蟲品種的布局具有極大的影響，因此，明確河南、安徽、山東和江蘇4省小麥短體線蟲的種類，對(duì)于指導(dǎo)我國(guó)小麥孢囊線蟲病和根腐線蟲病一體化綜合治理具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】國(guó)外已有大量關(guān)于短體線蟲危害麥類作物的報(bào)道，種類主要包括六裂短體線蟲（）、盧斯短體線蟲（）、落選短體線蟲（）、穿刺短體線蟲（）、斯克里布納短體線蟲（）、桑尼短體線蟲（）和玉米短體線蟲（）等，其中對(duì)小麥危害較大是落選短體線蟲、穿刺短體線蟲和桑尼短體線蟲[8-9]。我國(guó)安徽、四川、廣西、河南和西藏等地也有短體線蟲危害小麥的報(bào)道，已知種類包括落選短體線蟲、穿刺短體線蟲、咖啡短體線蟲（e）、玉米短體線蟲、盧斯短體線蟲、敏捷短體線蟲（）和草地短體線蟲（）等[10-15]。近年筆者實(shí)驗(yàn)室在黃淮麥區(qū)開展的田間調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)同一田塊存在多種短體線蟲混合發(fā)生的現(xiàn)象比較普遍，傳統(tǒng)的線蟲形態(tài)學(xué)鑒定需要有足夠數(shù)量的成蟲用于測(cè)計(jì)和形態(tài)學(xué)特征比較，尤其當(dāng)一個(gè)樣品中同時(shí)存在多種短體線蟲時(shí)，首先需要將不同的種區(qū)分開再依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，因此操作較為繁瑣且鑒定周期相對(duì)較長(zhǎng)。而分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用很好的解決了上述難題，Pinochet等[16]最早利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)鑒定傷殘短體線蟲（），Ouri等[17]利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)將短體線蟲7個(gè)種區(qū)分開，此后，特征序列擴(kuò)增區(qū)（sequence-characterized amplified regions，SCAR）[18-21]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[22]、DNA條形碼（DNA barcoding）[23]等分子技術(shù)也相繼應(yīng)用于短體線蟲的種類鑒定。其中，SCAR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，目前包括咖啡短體線蟲、落選短體線蟲、斯克里布納短體線蟲、盧斯短體線蟲、桑尼短體線蟲、玉米短體線蟲、傷殘短體線蟲等種類均有特異性引物報(bào)道[18-21]。此外，基于核糖體DNA（rDNA）和線粒體DNA（mtDNA）保守區(qū)序列的分析，同樣對(duì)短體線蟲種類鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化及遺傳變異分析具有重要意義，Subbotin等[24]比較了短體線蟲的rDNA 18S和28S D2-D3區(qū)序列，證實(shí)了短體線蟲的28S D2-D3區(qū)比18S具有更高的種間變異度，28S D2-D3區(qū)基因片段更適合作為分子鑒定的靶標(biāo)；王金成等[25]比較分析了短體線蟲rDNA的ITS區(qū)和28S D2-D3區(qū)序列，同樣認(rèn)為28S D2-D3區(qū)靶標(biāo)更適用于短體線蟲種類的檢測(cè)；而Janssen等[4]通過(guò)分析rDNA 28S、ITS以及mtDNA-COI基因序列澄清了穿刺短體線蟲、偽短體線蟲（）和鈴蘭短體線蟲（）分類地位的長(zhǎng)期爭(zhēng)議。當(dāng)前GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)積累了大量的短體線蟲rDNA 18S、28S D2-D3、ITS以及mtDNA-COI 序列信息，為利用上述基因進(jìn)行序列比對(duì)分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、種內(nèi)遺傳變異分析等提供了極大的便利?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于短體線蟲近緣種間的形態(tài)特征非常相似，且種內(nèi)形態(tài)變異較大[1]，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)混合群體的鑒定可能會(huì)存在誤差，而分子鑒定方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)小麥短體線蟲種類分子鑒定的系統(tǒng)研究較少。本研究對(duì)采自黃淮流域河南、安徽、山東和江蘇4省小麥孢囊線蟲發(fā)病田的10個(gè)小麥短體線蟲樣品進(jìn)行線蟲分離，提取單條線蟲DNA，分別利用rDNA和mtDNA序列比對(duì)分析、基于SCAR-PCR的種特異性引物擴(kuò)增兩種方法鑒定短體線蟲的種類?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用單條線蟲DNA擴(kuò)增rDNA 18S、28S D2-D3以及mtDNA-COI片段，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建以及序列相似度分析，明確我國(guó)黃淮麥區(qū)短體線蟲的種類發(fā)生情況，為今后我國(guó)小麥根部線蟲病的防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

于2016年12月冬小麥分蘗期和2017年4—5月抽穗楊花期，對(duì)我國(guó)黃淮流域江蘇、安徽、河南、山東4省小麥孢囊線蟲發(fā)病田的小麥根腐線蟲病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，采集小麥根系及根際土壤樣品共10份，具體地理信息見表1。采用淺盤法分離樣品中的線蟲，收集線蟲懸浮液，在體視顯微鏡下觀察線蟲的形態(tài)特征。根據(jù)短體線蟲的形態(tài)特征并結(jié)合文獻(xiàn)資料核對(duì)，對(duì)樣品中的短體線蟲進(jìn)行初步的鑒定。從各樣品中隨機(jī)挑取5條短體線蟲，用于DNA分子鑒定。

1.2 單條線蟲的DNA提取與分子片段的擴(kuò)增測(cè)序

單條線蟲的DNA提取參考宋志強(qiáng)等[26]的方法。將線蟲挑入滅菌ddH2O水滴中清洗1—2次后，挑取單條線蟲放入加有16 μL ddH2O和2 μL 10×PCR Buffer（Mg2+free）的200 μL PCR管中，液氮中冷凍2 min后，65℃處理1 min，重復(fù)3次；加入2 μL 10 μg·μL-1蛋白酶K，65℃溫育1 h，95℃處理10 min，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 rDNA與mtDNA通用引物擴(kuò)增測(cè)序

以短體線蟲單條DNA樣本為模板，分別采用rDNA 18S、28S D2-D3區(qū)以及mtDNA-COI等片段通用引物[27-29]進(jìn)行擴(kuò)增（表2），PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，5 μmol·L-1的上游引物和下游引物各2 μL，2×Ex Taq Mix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，52—55℃（按引物不同）退火30 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后送至南京擎科生物公司測(cè)序。

表1 黃淮麥區(qū)10個(gè)短體線蟲樣品的采集信息和種類鑒定

表2 本研究所用引物信息

1.4 序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用ContigExpress軟件將獲得的序列進(jìn)行拼接，用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析后，提交GenBank獲得登錄序列號(hào)。從NCBI下載國(guó)內(nèi)外有關(guān)短體線蟲種類和群體的rDNA 18S、28S D2-D3以及mtDNA-COI序列，利用軟件ClustalX1.81對(duì)所測(cè)短體線蟲序列和下載的短體線蟲序列進(jìn)行比對(duì)分析。采用軟件MEGA4.0的鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建短體線蟲的rDNA 18S、28S D2-D3和mtDNA-COI序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Boostrap值檢驗(yàn)分支聚類的可靠性[30]，進(jìn)化樹顯示置信度＞50%的數(shù)值。此外，使用MEGA4.0對(duì)鑒定的短體線蟲種類與不同地理種群進(jìn)行分子序列的差異度和相似度分析。

1.5 SCAR-PCR特異性引物驗(yàn)證

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹及序列比對(duì)分析結(jié)果，利用種特異性引物3對(duì)[18-20]（表2）對(duì)不同DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，5 μmol·L-1的上游引物和下游引物各2 μL，2×Ex Taq Mix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，60—66℃（按引物不同）退火30 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，根據(jù)相應(yīng)引物的擴(kuò)增片段大小檢測(cè)線蟲的種類。

2 結(jié)果

2.1 rDNA與mtDNA通用引物擴(kuò)增片段序列分析

首先用引物G18SU/R18TYL1擴(kuò)增各線蟲的rDNA 18S區(qū)，均得到一條約900 bp的條帶（圖1-A），各片段經(jīng)克隆測(cè)序后獲得的片段大小范圍在857—935 bp，序列比對(duì)分析顯示部分樣本間序列差異明顯，初步判斷小麥短體線蟲10個(gè)樣品中，有6個(gè)為短體線蟲混合種群侵染樣品，其余可能為短體線蟲單一種群侵染樣品。

根據(jù)18S序列分析比對(duì)結(jié)果，從6個(gè)混合種群侵染樣品中各選取序列有明顯差異的線蟲DNA樣本2個(gè)，從4個(gè)單一種群侵染樣品中各選取序列一致的線蟲DNA樣本2個(gè)（線蟲種群代碼見表1），用引物D2A/D3B擴(kuò)增rDNA 28S D2-D3區(qū)，所有樣本均得到一條約780 bp的條帶（圖1-B），測(cè)序得到的片段大小范圍在771—784 bp；用引物JB3/JB5擴(kuò)增mtDNA-COI區(qū)，均獲得了一條約400 bp的條帶（圖1-C），測(cè)序得到的片段大小范圍在415—417 bp。

A: rDNA 18S; B: rDNA 28S D2-D3; C: mtDNA-COI.1-20: JS1-1, JS1-2, JS2-1, JS2-2, AH2-1, AH2-2, AH3-1, AH3-2, AH4-1, AH4-2, AH5-1, AH5-2, HN1-1, HN1-2, HN2-1, HN2-2, HN3-1, HN3-2, SD1-1, SD1-2; M: DNA marker DL2000

2.2 短體線蟲種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI分別下載來(lái)自美國(guó)、英國(guó)、土耳其、日本、荷蘭、比利時(shí)、澳大利亞、伊朗、越南和肯尼亞等國(guó)家的短體線蟲不同種群的rDNA 18S、28S D2-D3和mtDNA-COI序列，與本研究獲得的序列一起構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2—圖4），用長(zhǎng)尾刺線蟲（）和細(xì)刺線蟲（）作為rDNA 18S樹的外群，用長(zhǎng)尾刺線蟲作為rDNA28S D2-D3樹的外群，用相似穿孔線蟲（）作為mtDNA-COI樹的外群。

圖2 基于rDNA 18S序列構(gòu)建的黃淮麥區(qū)短體線蟲種群鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 基于rDNA 28S D2-D3序列構(gòu)建的黃淮麥區(qū)短體線蟲種群鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 基于mtDNA-COI序列構(gòu)建的黃淮麥區(qū)短體線蟲種群鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹

從rDNA 18S系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）可以看出，安徽小麥短體線蟲種群AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2和AH5-2，以及河南小麥的短體線蟲種群HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1，均與咖啡短體線蟲日本、中國(guó)群體和史佩奇短體線蟲（）中國(guó)群體聚類在一個(gè)分支，置信度達(dá)到94%。安徽小麥短體線蟲種群AH2-2、AH4-1和AH5-1，江蘇小麥短體線蟲種群JS1-2、JS2-1和JS2-2，河南小麥短體線蟲種群HN1-2和HN3-2，以及山東小麥短體線蟲種群SD1-1和SD1-2，均與落選短體線蟲日本群體和美國(guó)群體聚類在一個(gè)大分支，置信度達(dá)到100%。而江蘇小麥短體線蟲種群JS1-1與斯克里布納短體線蟲美國(guó)群體和敏捷短體線蟲聚類于一個(gè)大分支，置信度達(dá)到100%。

基于rDNA 28S D2-D3序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）顯示，AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2、AH5-2、HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1這9個(gè)種群均與咖啡短體線蟲的美國(guó)、伊朗、越南群體聚類在一個(gè)分支，置信度達(dá)到99%，且與史佩奇短體線蟲處于完全不同的進(jìn)化分支；AH2-2、AH4-1、AH5-1、JS1-2、JS2-1、JS2-2、HN1-2、HN3-2、SD1-1和SD1-2這10個(gè)種群均與落選短體線蟲的中國(guó)、美國(guó)、加拿大群體聚類在一個(gè)分支，置信度達(dá)到100%；而種群JS1-1與斯克里布納短體線蟲的中國(guó)、美國(guó)群體和六裂短體線蟲的土耳其、比利時(shí)群體聚類在一個(gè)分支，置信度達(dá)到100%。

基于mtDNA-COI序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）與rDNA 28S D2-D3進(jìn)化樹樹形相似，20個(gè)短體線蟲種群分別聚類在咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲的不同分支里，置信度均為100%。

2.3 短體線蟲種群的rDNA 28S和mtDNA-COI序列相似度分析

對(duì)咖啡短體線蟲安徽群體AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2和AH5-2，以及河南群體HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1的28S D2-D3序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，9個(gè)群體的序列差異值在0.000—0.010，相似度為99.0%—100%，它們與已知中國(guó)群體的差異值也在0.000—0.010，相似度為99.0%—100%，而與咖啡短體線蟲的巴西、美國(guó)、日本、越南群體的序列差異值在0.000—0.013，相似度為98.7%—100%（表3）；此外，這9個(gè)群體的mtDNA-COI序列差異值在0.000—0.003，相似度為99.7%—100%，它們與咖啡短體線蟲日本群體（KU1098942和KU198943）的序列差異值同樣是在0.000—0.003，相似度為99.7%— 100%（表4）。

表3 咖啡短體線蟲不同群體間的rDNA 28S D2-D3 序列差異值

對(duì)落選短體線蟲安徽群體AH2-2、AH4-1和AH5-1，江蘇群體JS1-2、JS2-1和JS2-2，河南群體HN1-2和HN3-2，以及山東群體SD1-1和SD1-2的28S D2-D3序列進(jìn)行相似度分析，從表5中可以看出，這10個(gè)群體序列間的差異值在0.000—0.020，相似度在98.0%—100%；它們與已知中國(guó)群體的差異值在0.011—0.020，相似度為98.0%—98.9%，而與落選短體線蟲美國(guó)、比利時(shí)、伊朗、韓國(guó)、英國(guó)、捷克、玻利維亞群體的序列差異值同樣是在0.000—0.020，相似度為98.0%—100%。此外，這10個(gè)群體的mtDNA-COI序列差異值在0.000—0.003之間，相似度在99.7%—100%，它們與落選短體線蟲美國(guó)群體（KU198941）和中國(guó)群體（KY424103）的序列差異值在0.029—0.032，相似度在96.8%—97.1%（表6）。

表4 咖啡短體線蟲不同群體間的mtDNA-COI序列差異值

表5 不同落選短體線蟲群體間的rDNA 28S D2-D3序列差異值

表6 不同落選短體線蟲群體間的mtDNA-COI序列差異值

將江蘇群體JS1-1的28S D2-D3序列與斯克里布納短體線蟲美國(guó)群體（KT873859、KX842628和EU130865）以及中國(guó)群體（KM094196和JX047004）的序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示它們之間的差異值在0.000—0.004，相似度為99.6%—100%；JS1-1的mtDNA-COI序列與斯克里布納短體線蟲中國(guó)群體（KX349425）的序列差異值為0.012，相似度為98.8%。

通過(guò)對(duì)黃淮流域4省10個(gè)小麥短體線蟲樣品的種群系統(tǒng)進(jìn)化樹及序列相似性的綜合分析，揭示江蘇沛縣樣品JS2和山東濰坊樣品SD1是落選短體線蟲單一種群，河南永城樣品HN2和安徽淮北樣品AH3是咖啡短體線蟲單一種群，江蘇徐州樣品JS1是落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲的混合種群，而安徽蕭縣樣品AH2和AH5、安徽淮北樣品AH4以及河南永城樣品HN1和HN3，均為咖啡短體線蟲和落選短體線蟲的混合種群（表1）。

2.4 短體線蟲種群的SCAR引物檢測(cè)

利用SCAR引物對(duì)表1中的20個(gè)短體線蟲種群DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，咖啡短體線蟲SCAR引物對(duì)PC1/PC2僅從AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2、AH5-2、HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1等9個(gè)樣本中各擴(kuò)增出一條約630 bp的條帶（圖5條帶7、10、13所示），與預(yù)期的條帶大小相一致，而落選短體線蟲SCAR引物對(duì)PNEG-F1/D3B5和斯克里布納短體線蟲SCAR引物對(duì)PsF7/PsR7從上述樣品中均沒有擴(kuò)增出條帶，表明這些樣本均為咖啡短體線蟲。引物對(duì)PNEG-F1/D3B5僅從JS1-2、JS2-1、JS2-2、AH2-2、AH4-1、AH5-1、HN1-2、HN3-2、SD1-1和SD1-2等10個(gè)樣本中各擴(kuò)增出約一條約140 bp的條帶（圖5條帶5、17、20所示），與預(yù)期的落選短體線蟲擴(kuò)增片段大小相一致；而引物對(duì)PsF7/ PsR7僅從JS1-1樣本中擴(kuò)增出130 bp的條帶，與預(yù)期的斯克里布納短體線蟲擴(kuò)增片段大小相一致（圖5條帶3所示）。SCAR檢測(cè)結(jié)果表明，10個(gè)小麥短體線蟲樣品里20個(gè)短體線蟲種群的單條DNA樣本中，有9個(gè)為咖啡短體線蟲，10個(gè)為落選短體線蟲，僅1個(gè)為斯克里布納短體線蟲，這與上述基于rDNA和mtDNA序列分析得出的結(jié)果相一致。

3 討論

短體線蟲屬不僅種類多，而且種間形態(tài)特征差異較小，種類鑒定難度比較大；此外，線蟲的形態(tài)特征測(cè)計(jì)往往需要一定數(shù)量的成蟲，對(duì)于群體密度較低或者混合種群的樣本而言，形態(tài)測(cè)計(jì)容易產(chǎn)生誤差，會(huì)導(dǎo)致依據(jù)形態(tài)特征鑒定的種類與實(shí)際情況不符。而基于線蟲DNA發(fā)展起來(lái)的多種分子鑒定技術(shù)，作為形態(tài)鑒定的一種輔助手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于線蟲近似種的分類鑒定中[31]。盡管目前已開發(fā)了針對(duì)多種短體線蟲的SCAR特異性引物[18-21]，但是采用該方法需要分別使用多種引物對(duì)同一DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，如果特異性引物與樣本的種類沒有對(duì)應(yīng)，就不會(huì)有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，從而無(wú)法對(duì)線蟲種類進(jìn)行檢測(cè)鑒定。本文首先通過(guò)擴(kuò)增短體線蟲的rDNA 18S、28S D2-D3和mtDNA-COI片段，利用所測(cè)得的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行序列相似度分析，初步明確樣本的種類，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用SCAR特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，成功地利用單條短體線蟲DNA樣本對(duì)采自黃淮流域4省的10個(gè)小麥短體線蟲樣品進(jìn)行了種類鑒定。

1、4、7、10、13、16、19：咖啡短體線蟲SCAR引物PC1/PC2 SCAR primers PC1/PC2 for P. coffeae；2、5、8、11、14、17、20：落選短體線蟲SCAR引物PNEG-F1/D3B5 SCAR primers PNEG-F1/D3B5 for P. neglectus；3、6、9、12、15、18、21：斯克里布納短體線蟲SCAR引物PsF7/ PsR7 SCAR primers PsF7/ PsR7 for P. scribneri；M：DNA marker DL2000

通過(guò)分析rDNA 18S系統(tǒng)進(jìn)化樹筆者發(fā)現(xiàn)，本研究測(cè)定的咖啡短體線蟲群體與史佩奇短體線蟲群體聚類在一個(gè)進(jìn)化分支中，而在rDNA 28S和mtDNA-COI樹中，咖啡短體線蟲群體與史佩奇短體線蟲群體聚類在不同的進(jìn)化分支中。究其原因可能是由于rDNA 18S基因進(jìn)化速率相對(duì)較慢，種間保守性高，更適合于屬間系統(tǒng)進(jìn)化分析[32]，因此無(wú)法將咖啡短體線蟲和史佩奇短體線蟲區(qū)分開；rDNA 28S基因是區(qū)分動(dòng)物物種及其近緣種的有效標(biāo)記之一[33]，在植物寄生線蟲同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化研究中也有廣泛應(yīng)用；mtDNA-COI基因由于具有單親遺傳、無(wú)重組、進(jìn)化速率相對(duì)較快等特點(diǎn)，在分子遺傳學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用[34]，也是近年來(lái)物種條形碼研究的熱點(diǎn)。通過(guò)進(jìn)一步分析咖啡短體線蟲與落選短體線蟲rDNA 28S和mtDNA-COI序列可以看出，后者在兩種短體線蟲的種內(nèi)遺傳變異較前者更小，物種的辨識(shí)度更高。JansseN等[4]也證實(shí)mtDNA-COI分子靶標(biāo)相比較rDNA 28S和ITS靶標(biāo)可以更好地將穿刺短體線蟲復(fù)合種群（species complex）成員穿刺短體線蟲、偽短體線蟲和鈴蘭短體線蟲有效區(qū)分開，因此本文的結(jié)果也支持了mtDNA-COI分子靶標(biāo)比rDNA 18S和28S分子靶標(biāo)更適合于短體線蟲種類的分子鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究。

李廣帥[35]對(duì)河南省9個(gè)地區(qū)采集的23個(gè)小麥短體線蟲樣品進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子鑒定，認(rèn)為其中有15個(gè)樣品為敏捷短體線蟲，其余8個(gè)樣品為盧斯短體線蟲。本研究對(duì)河南商丘地區(qū)采集的樣品進(jìn)行了鑒定，并未發(fā)現(xiàn)上述兩種短體線蟲，由于采樣地點(diǎn)不同，無(wú)法排除不同地域線蟲種類存在差異的可能性，但通過(guò)進(jìn)一步的序列比對(duì)分析，筆者發(fā)現(xiàn)河南省鄭州市惠濟(jì)區(qū)敏捷短體線蟲群體ZMZZ的ITS序列（JQ039330）[36]與已報(bào)道的敏捷短體線蟲美國(guó)群體（FJ712889）及中國(guó)山西群體（KC952982）[37]的相似性僅為90.8%和91.0%，而中國(guó)山西群體與美國(guó)群體的相似性高達(dá)98.0%。目前的有效種地位受到質(zhì)疑，被認(rèn)為可能是的同種異名[38-39]，本研究分析發(fā)現(xiàn)ZMZZ群體與斯克里布納短體線蟲江蘇沛縣群體JS1-1（MG906767）和美國(guó)群體（KX842626）的ITS序列相似性僅為88.9%和90.0%，由于ZMZZ群體僅報(bào)道了ITS序列，無(wú)法進(jìn)一步比較分析，因此，河南ZMZZ群體的種類還有待核實(shí)與商榷。

此外，盧斯短體線蟲是咖啡短體線蟲復(fù)合種群（species complex）成員之一[40]，形態(tài)特征與咖啡短體線蟲非常相似，盧斯短體線蟲區(qū)別于咖啡短體線蟲的形態(tài)特征僅僅為更細(xì)的蟲體，陰門位置稍偏后，尾形偏窄，尾末端窄圓或鈍尖[3]。通過(guò)文獻(xiàn)核查，筆者發(fā)現(xiàn)此前報(bào)道的盧斯短體線蟲8個(gè)河南群體的尾形，明顯寬于參考文獻(xiàn)描繪的盧斯短體線蟲尾形，且尾末端寬圓，由于這8個(gè)河南群體缺乏清晰的分子信息，因此這些河南群體的種類還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過(guò)rDNA 18S、28S以及mtDNA-COI序列分析和SCAR鑒定方法，對(duì)我國(guó)黃淮流域江蘇、安徽、河南、山東4省小麥孢囊線蟲發(fā)病田中的10個(gè)短體線蟲樣品進(jìn)行了種類鑒定，揭示黃淮麥區(qū)的短體線蟲種類有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲，其中落選短體線蟲是優(yōu)勢(shì)種群，短體線蟲不同種群復(fù)合侵染小麥發(fā)生比較普遍。基于mtDNA-COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以有效區(qū)分短體線蟲的近緣種，相比rDNA 18S和28S基因更適于短體線蟲種類的分子鑒定。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Molecular Identification ofSpecies in 10 Samples Collected from Wheat Field in Huanghuai Region of China

Liu HaiLu, Wang Xuan, Li Hongmei, Li Yanxia, Xue Bowen, Ma Jukui

(College of Plan Protection, Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests, Ministry of Education, Nanjing 210095)

【Objective】Thespecies are migratory endoparasites of plant roots, causing root lesion of many crops and great damage of agricultural production all over the world. In order to clarify the species of genusco-infection withon wheat from Huanghuai region of China, 10 samples were collected from wheat field in 4 provinces of the region and thespecies were molecularly identified. The phylogenetic relationship ofspecies and genetic variation of intraspecific populations were analyzed. The results will provide valuable information for the integrated control of nematode diseases on wheat root. 【Method】Thenematodes were extracted from 10 samples collected from wheat fields infected within Jiangsu, Anhui, Henan and Shandong provinces. Fivenematodes were randomly picked up from each sample, and the DNA of individual nematode was extracted as the template for PCR amplification. The fragments of rDNA 18S region were amplified and the PCR products were sequenced. The BLAST alignment of 18S sequences revealed the differentspecies may present in these samples. The DNA templates of two representative specimens from each sample were selected for the further amplification of fragments from rDNA 28S D2-D3 region and mtDNA-COI gene. The fragments were sequenced and the BLAST alignments were performed. The phylogenetic trees were constructed on basis of rDNA 18S, 28S D2-D3 and mtDNA-COI sequences using neighbor-joining method by MEGA4.0 software, respectively. Thespecies identification was supported by the analyses of phylogenetic relationships and sequence similarities. The species-specific primers as the sequence-characterized amplified regions (SCAR) markers were used to validate the identification. 【Result】The fragments amplified from rDNA 18S region of 50 individual nematodes were sequenced and the sizes were 857-935 bp. The BLAST searching revealed that the mixedpopulations might present in some samples. The sequence sizes of the rDNA 28S D2-D3 fragments amplified from 20 selected specimens were 771-784 bp, the sizes of mtDNA-COI were 415-417 bp. The phylogenetic analyses as well as the comparisons of sequence similarities both demonstrated that threespecies including,and,were found in 10 samples collected from wheat fields in 4 provinces of Huanghuai region. Among 10 samples, the sample JS2 from Peixian of Jiangsu Province and SD1 from Weifang of Shandong Province were infected only with, HN2 from Yongcheng of Henan Province and AH3 from Huaibei of Anhui Province were infected only with. The samples AH2 and AH5 from Xiaoxian and AH4 from Huaibei of Anhui Province as well as HN1 and HN3 from Yongcheng of Henan Province were all co-infected withand, and JS1 from Xuzhou of Jiangsu Province was co-infected with. The DNA templates from 20 representative specimens were amplified using SCAR primers. The results showed that a single band of 140 bp was amplified from JS1-2, JS2-1, JS2-2, AH2-2, AH4-1, AH5-1, HN1-2, HN3-2, SD1-1 and SD1-2 using specific primer PNEG-F1/D3B5 for, a single band of 630 bp was amplified from AH2-1, AH3-1, AH3-2, AH4-2, AH5-2, HN1-1, HN2-1, HN2-2 and HN3-1 using primer PC1/PC2 for,a single band of 130 bp was amplified from JS1-1 using primer PsF7/PsR7 forThe results of SCAR detection confirmed the species identification mentioned above.【Conclusion】The molecular identification demonstrated that three species,,and, were found in wheat fields infested withfrom four provinces in Huanghuai region, andis the dominant species. The co-infection of differentspecies occurred quiet common in wheat field from the region. The phylogenetic tree based on mtDNA-COI gene can effectively distinguish the close relatedspecies, therefore, it is more suitable to identifyspecies than rDNA 18S and 28S markers.

spp.; species identification; rDNA; mtDNA; phylogeny; SCAR

2018-02-05；

2018-05-02

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201503114）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31471751）

劉海璐，E-mail：2015102038@njau.edu.cn。通信作者王暄，E-mail：xuanwang@njau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.006