一、口蹄疫臨床癥狀和發(fā)病及流行特點(diǎn)

口蹄疫是一種全球性傳染病，傳播無國界，可引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。對國家的政治、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)有嚴(yán)重影響，故稱為“政治經(jīng)濟(jì)病”。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的以偶蹄動(dòng)物為主的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播迅速、發(fā)病率高，患病畜口腔黏膜、舌面、鼻鏡、蹄叉、蹄冠部及乳頭形成水泡和潰瘍爛斑。

2010年4月，日本暴發(fā)O型口蹄疫，撲殺29萬頭家畜。國寶級肉牛品牌宮崎牛幾乎絕種。損失800億日元(合人民幣62億元)，喪失保持10年無FMD局面，畜產(chǎn)品被禁止出口。

（一）臨床癥狀

急性經(jīng)過持續(xù)一至數(shù)日，出現(xiàn)典型的臨床癥狀；亞急性經(jīng)過可持續(xù)2、3周。FMD發(fā)病初始，往往出現(xiàn)精神抑郁、發(fā)熱、流涎、跛行，特征性癥狀是口、鼻、蹄及乳房等無毛部位出現(xiàn)水泡繼而水泡破裂，形成潰瘍、結(jié)痂，痂塊脫落后形成斑痕，繼而水泡破裂，形成潰瘍、結(jié)痂，痂塊脫落后形成斑痕。

（二）口蹄疫基本特點(diǎn)

1.FMD的易感動(dòng)物種類繁多。包括20多個(gè)科70多個(gè)種的野生動(dòng)物，重要經(jīng)濟(jì)畜種豬、牛、羊、鹿、駱駝等都易感，因動(dòng)物價(jià)值高，撲殺病畜阻力大，補(bǔ)償費(fèi)用很大，欠發(fā)達(dá)地區(qū)FMD防治政策難以推進(jìn)。

2.FMDV血清型多，血清型間不能交叉免疫。具有七個(gè)血清型，A、O、C、Asia1型和SAT1、SAT2和SAT3，型間不能交叉免疫保護(hù)，同型內(nèi)不同病毒株的抗原性也有不同，免疫防治等于面對七種以上不同的傳染病。

3.病原變異性極強(qiáng)。FMDV基因組具有小RNA病毒的特性，病毒變異性強(qiáng)。型內(nèi)不同病毒株間的遺傳變異可導(dǎo)致抗原差異，每逢新變異株的出現(xiàn)，就會(huì)導(dǎo)致一次新的疫情高潮。

4.FMDV的感染性和致病力特別強(qiáng)。極少量的病毒就能引起發(fā)病。牛只要吸入10個(gè)感染單位就可發(fā)病，病豬每天僅從呼吸道排出的病毒就高達(dá)108個(gè)感染單位，也就是說，一頭病豬一天呼出的病毒如全被牛吸入，可使1百萬頭牛發(fā)病。

5.FMD有多種傳播方式和感染途徑。FMDV主要經(jīng)由呼吸道、消化道和接觸等途徑感染；與感染動(dòng)物、污染的動(dòng)物產(chǎn)品、人員、污染物及裝置的（直接或間接）接觸都可感染。氣象條件合適時(shí)，病毒可向下風(fēng)方向傳播幾十甚至上百公里的距離，1981年，英國懷特（Wight）島的牛被隨風(fēng)傳送的法國布列塔尼（Brittany）發(fā)病豬產(chǎn)生的氣溶膠病毒感染，病毒跨越英吉利海峽傳播了250 km。

6.FMD的潛伏期短，發(fā)病急。動(dòng)物感染病毒后最快十幾小時(shí)就可發(fā)病排毒，感染動(dòng)物能從多種途徑分泌/排泄出大量病毒，大量動(dòng)物被感染集中發(fā)病令人猝不及防。

7.與其它動(dòng)物病毒相比，動(dòng)物機(jī)體對FMDV的免疫應(yīng)答程度較低。免疫動(dòng)物及發(fā)病后康復(fù)動(dòng)物，再次受到同源病毒攻擊時(shí)部分動(dòng)物有可能不保護(hù)；加強(qiáng)免疫接種也不能完全避免FMD臨床病例的出現(xiàn)；疫苗免疫持續(xù)期短。

8.FMDV有較強(qiáng)的抵抗力和存活力。FMDV對外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，在自然情況下含毒組織和病毒污染的飼料、飼草、皮毛及土壤等可保持傳染性達(dá)數(shù)周甚至數(shù)月之久。

9.可使反芻動(dòng)物長期帶毒。加強(qiáng)免疫接種也不能完全避免FMD臨床病例的出現(xiàn)；被FMDV感染過的反芻動(dòng)物會(huì)成為不表現(xiàn)臨床癥狀的的持續(xù)性感染動(dòng)物，是一個(gè)潛在的、引發(fā)疫病暴發(fā)的病毒傳染來源。

二、口蹄疫檢測技術(shù)

口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測方法包括口蹄疫阻斷ELISA方法、口蹄疫單抗競爭ELISA方法、口蹄疫膠體金試紙條。

1. 液相阻斷ELISA。1986年，Hablin等人以病毒中和實(shí)驗(yàn)（VNT）和液相ELISA實(shí)驗(yàn)原理，建立了液相阻斷ELISA（LB-ELISA），主要用于檢測血清中的FMD抗體。LB-ELISA現(xiàn)在是國際獸醫(yī)局（OIE）頒布的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，也是國際貿(mào)易指定的檢測方法。

液相阻斷ELISA的反應(yīng)步驟優(yōu)化。液相阻斷ELISA抗原抗體反應(yīng)是在血清稀釋板上進(jìn)行，37℃反應(yīng)90 min或者4℃過夜，再轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板上被包被抗體所捕獲，37℃反應(yīng)60 min才能使抗原完全結(jié)合至酶標(biāo)板上；而我們通過對反應(yīng)體系的改進(jìn)，抗原抗體反應(yīng)在酶標(biāo)板上進(jìn)行，使抗原抗體的阻斷反應(yīng)和抗原的捕獲在酶標(biāo)上同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，極大的提高了反應(yīng)效率。改進(jìn)型液相阻斷ELISA將液相阻斷ELISA抗原抗體的反應(yīng)時(shí)間從150 min優(yōu)化至30 min，減少了反應(yīng)時(shí)間和操作步驟，方便用戶實(shí)驗(yàn)操作。改進(jìn)型液相阻斷ELISA試劑盒使用HRP標(biāo)記的一抗用于檢測阻斷抗體，相比于液相阻斷ELISA取消了酶標(biāo)二抗的反應(yīng)步驟，使反應(yīng)步驟由兩步簡化為一步反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間由60 min減少為30 min。

2.口蹄疫分子診斷學(xué)方法。熒光定量PCR主要分為兩大類，染料法和探針法。熒光探針是在探針的5’端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（R），3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Q），兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5’端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被淬滅基團(tuán)吸收或抑制，當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號增強(qiáng)，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可收到熒光信號。

口蹄疫定型熒光定量RT-PCR試劑盒特點(diǎn)：（1）特異性好，覆蓋面廣，能夠檢測我國及周邊國家目前主要流行毒株；（2）敏感性高，可以檢測到10個(gè)拷貝/ul；（3）更加高效，能夠在一個(gè)體系中同時(shí)鑒定目前在國內(nèi)流行的口蹄疫三個(gè)型。

3. 口蹄疫單抗競爭ELISA抗體檢測試劑盒。本試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)是以病毒中和實(shí)驗(yàn)(VNT)為參照，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)SPCE方法與VNT的相關(guān)性為0.93，其效價(jià)與中和效價(jià)高度相關(guān)，中和抗體與保護(hù)效力高度相關(guān)。檢測結(jié)果既可定血清型，也可以定血清抗體效價(jià)。反應(yīng)特點(diǎn)：（1）特異性好：血清型間，無交叉反應(yīng)；（2）反應(yīng)譜廣：血清型內(nèi)，與歷史毒株和流行毒株都很好反應(yīng)。檢測特點(diǎn)：可測定血清型，也可測定抗體效價(jià)。

4. 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測方法。單抗阻斷ELISA抗體檢測方法、酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗(yàn)（EITB)或（FMDV Multi-NSPs Dot-blot）、2C3AB金標(biāo)試紙條。

5. 口蹄疫分子診斷學(xué)方法。熒光定量PCR主要分為兩大類，染料法和探針法。熒光探針是在探針的5’端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（R），3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Q），兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5’端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被淬滅基團(tuán)吸收或抑制，當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號增強(qiáng)，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可收到熒光信號。

三、其他動(dòng)物疫病診斷技術(shù)

1. 禽流感病毒H7N9（H7hi/H7lo/N9）三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測試劑盒。H7N9是A型流感病毒，屬單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，其基因組編碼至少11種蛋白，主要包括表面基因HA和NA蛋白，以及6個(gè)內(nèi)部基因蛋白。H7N9是新型重組病毒，其HA來源于H7N3，NA來源于H4N9等病毒，內(nèi)部基因來源于H9N2亞型禽流感病毒，該病毒可引起人和雞發(fā)病和死亡。

2. 豬病毒性腹瀉的四重?zé)晒舛縍T-PCT。豬病毒性腹瀉的病原種類繁多、感染狀況錯(cuò)綜復(fù)雜，豬腸道冠狀病毒四重?zé)晒舛縍T-PCR試劑盒結(jié)合我國豬場病毒性腹瀉最新流行特點(diǎn)，同時(shí)檢測傳統(tǒng)的豬傳染性胃腸炎病毒、變異的豬流行性腹瀉病毒，以及近年來新發(fā)的豬德爾塔冠狀病毒和豬A型腸道冠狀病毒。

優(yōu)點(diǎn)：兼容性強(qiáng)、根據(jù)各類病毒保守基因全新設(shè)計(jì)；特異性高，不與其他病毒基因結(jié)合；敏感性好，可檢測幾十個(gè)病毒基因拷貝數(shù)；熒光信號強(qiáng)、類型通用，常規(guī)熒光定量PCR儀均可使用；程序簡單、省時(shí)省力、精準(zhǔn)高效。

3. 羊棘球蚴（包蟲）病自然感染抗體ELISA檢測試劑盒。利用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及結(jié)合免疫學(xué)新技術(shù)，分離鑒定棘球蚴病特異性候選抗原；制備了羊棘球蚴病陽性、陰性血清；建立了羊棘球蚴病血清學(xué)間接ELISA診斷方法。

4. 豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒。優(yōu)點(diǎn)：（1）相對于單抗阻斷ELISA，該試劑盒具有更好的敏感性，排除了相對單一表位抗體豐度不足時(shí)引起的假陽性；（2）相對于國內(nèi)其他試劑盒，大大縮短檢測時(shí)間，2 h以內(nèi)可完成檢測；（3）該試劑盒具有較好的重復(fù)性，同一血清（n=48），板內(nèi)變異系數(shù)CV＜8%，板間變異系數(shù)＜10；（4）能夠準(zhǔn)確、客觀的反應(yīng)免疫效果及血清中特異性豬瘟抗體的相對含量；（5）1 000份血清結(jié)果驗(yàn)證，與IDEXX、金諾阻斷比對，整體符合率在85%-90%之間。

5. 布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒。布魯氏菌競爭ELISA抗體檢測試劑盒靈敏度達(dá)97.9%，是傳統(tǒng)方法的5～10倍，適用于對可疑樣品的檢測特異性可達(dá)96.3%，能夠有效區(qū)分與布魯氏菌存在血清學(xué)干擾的大腸桿菌O157、耶爾森氏菌O9等陽性血清。

特點(diǎn)：（1）《2016-2020年度國家布病防控計(jì)劃》已將競爭ELISA方法列入動(dòng)物布病確診檢測方法之一；（2）本試劑盒即是通過特異性單克隆抗體與待檢血清中的抗體，競爭性結(jié)合包被在ELISA板中的布魯氏菌抗原；（3）由于其加入針對布魯氏菌的單抗，與傳統(tǒng)方法相比其靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用于大部分易感動(dòng)物如牛、羊等動(dòng)物；（4）方法操作便捷、耗時(shí)短；檢測使用酶標(biāo)顯色系統(tǒng)，結(jié)果易于判定。

四、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷操作注意事項(xiàng)

（一）分子診斷實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置

1. 分成不同的工作區(qū)域。每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備，專用的加樣器和槍尖等。標(biāo)記清晰準(zhǔn)確，如加樣器或試劑等。單一方向順序，從準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、體系混合區(qū)及加樣區(qū)。不同的區(qū)域推薦使用不同（顏色）的工作服。實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)至加樣區(qū)。不同區(qū)域使用各自的清潔用具。

2. 各區(qū)域的功能。（1）準(zhǔn)備區(qū)功能：儲(chǔ)存試劑的制備，試劑的分裝；反應(yīng)混合液的制備及分裝；加陰性對照；（2）樣本處理區(qū)功能：臨床樣本的處理（破碎）、保存；（3）核酸提取區(qū)功能：核酸提取及保存；（4）擴(kuò)增區(qū)功能：將準(zhǔn)備區(qū)分裝好的反應(yīng)體系和提取的核酸混合，并加陽性對照。

3. 準(zhǔn)備區(qū)。（1）戴手套；（2）含反應(yīng)混合液的離心管在解凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒；（3）工作結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面紫外照射半個(gè)小時(shí)以上；（4）實(shí)驗(yàn)室及設(shè)備的使用必須要有日常記錄。

4. 樣本處理區(qū)。（1）要正確使用加樣器；（2）為避免樣本間污染，最好不要同時(shí)打開多個(gè)樣本；（3）對具有潛在污染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序；（4）用過的加樣器槍頭必須放入專門的消毒容器中。

5. 核酸提取區(qū)。（1）RNA標(biāo)本使用的槍頭離心管必須無菌且RNA-free；（2）工作臺(tái)面必須潔凈。用過的加樣器槍頭必須放入專門的消毒容器中；（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)束及時(shí)進(jìn)行清潔。

6. 擴(kuò)增區(qū)。（1）將制備好的核酸加入反應(yīng)混合液；（2）將陽性對照加入反應(yīng)混合液；（3）需在超凈臺(tái)進(jìn)行；（4）加好所有樣品之后應(yīng)快速離心數(shù)秒；（5）整個(gè)PCR過程在冰上操作；（6）混合體系加好后必須立即上機(jī)，不能放置。

（二）PCR污染與對策

1. 污染的預(yù)防。（1）PCR的前處理與后處理要在不同的隔離工作臺(tái)上或房間內(nèi)進(jìn)行；（2）分裝試劑，標(biāo)記批號；（3）改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作，帶一次性手套、槍頭，槍頭不要暴露于空氣；避免反應(yīng)液的飛濺；操作多份樣品時(shí)，要先將可混勻的成分一起制備成混合液；最后加入樣品，并且在加入每一管核酸后，立即蓋緊管蓋；（4）檢查結(jié)果的可重復(fù)性。

2. 污染源的追蹤。常見的環(huán)境污染源有：加樣器、清潔用具、離心機(jī)、槍尖、離心管、冰箱門把手。

3. 污染源的處理。（1）化學(xué)處理法：實(shí)驗(yàn)易污染的部位或器械可用1mol/L HCL擦拭核酸降解液（隨時(shí)隨地）；（2）紫外法：紫外線照射對于長片段（500bp以上）有效，而對短片段效果不大。

4. 因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問題分析。（1）儀器使用不當(dāng)引起的污染問題：①離心機(jī)：必須配平；②移液器：嚴(yán)禁大力來回?cái)Q動(dòng)，嚴(yán)禁調(diào)至容量之外使用，槍頭應(yīng)浸入液面2～3 mm處吸取，嚴(yán)禁將有液體的移液器平放或倒置，每周用75%乙醇清洗一次；（2）實(shí)驗(yàn)室布局不合理引起的污染問題：①樣品處理不進(jìn)行隔離，樣品中各種核酸片段均會(huì)通過空氣進(jìn)行傳播；②儀器設(shè)備及工作服等（尤其是加樣器）公用，造成嚴(yán)重污染；③實(shí)驗(yàn)室操作垃圾亂放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實(shí)驗(yàn)室污染。

（三）血清學(xué)方法檢測結(jié)果的影響因素

1. 試劑因素。試劑質(zhì)量是影響檢測結(jié)果的直接因素，其抗原抗體的純度，標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性，抗體的親和力、滴度和特異性，標(biāo)記物的比活性或免疫活性等。均對測定結(jié)果產(chǎn)生直接影響。還有試劑盒的穩(wěn)定有效期，運(yùn)輸條件及儲(chǔ)存方式等也均會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響。

2. 標(biāo)本因素。（1）內(nèi)源性因素：ELISA檢測中會(huì)出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，主要是由抗原或抗體過量引起，在一步法反應(yīng)中頻繁出現(xiàn)。固相競爭ELISA克服了這種缺陷，但在檢測豬血清過程中仍偶爾出現(xiàn)鉤狀結(jié)果，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。這是由于血清中內(nèi)源性因子非特異性結(jié)合引起的，通過高倍稀釋或加入百分之五的異源血清可以緩解內(nèi)源性因子的干擾；（2）外源性因素：包括標(biāo)本溶血、細(xì)菌污染、保存不當(dāng)、凝集不全和添加劑的干擾作用等。

3. 實(shí)驗(yàn)原理或操作方法。ELISA試劑盒操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。ELISA試劑盒操作大體分為四部分，以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。

（1）加樣操作的影響：加樣速度適中，避免加樣于孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快或太慢，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性；加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附；濺出會(huì)對鄰近孔產(chǎn)生污染；出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異；

（2）溫育的影響：溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2℃～8℃。溫育時(shí)間不夠，弱陽性標(biāo)本檢測不出；溫育溫度不夠，弱陽性標(biāo)本也難以檢出；

（3）洗板的影響：在ELISA操作中，洗板是關(guān)鍵步驟之一，可除去樣液中非特異性吸附在固相載體上的干擾物、游離的抗體和酶標(biāo)記物，保證反應(yīng)的定量關(guān)系，洗滌不充分直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性，甚至“花板”導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)失敗。因此洗板次數(shù)、注水量應(yīng)符合要求，洗板方法也要正確，洗板次數(shù)也并非越多越好，拍板用的紙重復(fù)使用也可能造成污染。洗板次數(shù)較少，造成殘留，可引起假陽性結(jié)果；洗板次數(shù)過多，可造成抗原抗體結(jié)合物洗脫，造成假陽性結(jié)果。

（4）顯色的影響：影響顯色的關(guān)鍵是顯色溫度和顯色時(shí)間，顯色時(shí)間過長或過短均會(huì)造成弱陽性標(biāo)本不能顯色而導(dǎo)致假陰性發(fā)生。ELISA實(shí)驗(yàn)終止液反應(yīng)后依然會(huì)引起顏色的持續(xù)變化，影響陰性和弱陽性樣品及定量檢測樣品的結(jié)果，特別在大批樣品需較長時(shí)間進(jìn)行讀數(shù)時(shí)，這種潛在的顏色逐漸變化現(xiàn)象成為結(jié)果影響的重要因素。

4. 環(huán)境因素。（1）通風(fēng)、采光與防塵；（2）環(huán)境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異應(yīng)使用系統(tǒng)空調(diào)進(jìn)行控溫，并要求控制空氣濕度為40%～70%之間；（3）穩(wěn)定水電，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)采用蒸餾水(純水)或經(jīng)軟化處理的自來水。