魯長(zhǎng)風(fēng)，楊淑慧，王沖，楊軒，陳鵬，黃紹代，王玉，汪愛(ài)媛，林秋霞，許文靜，盧世璧，彭江

自組裝多肽（SAP）納米纖維水凝膠近年來(lái)在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛關(guān)注，并應(yīng)用到腦、外周神經(jīng)、心臟和骨的修復(fù)中[1]。分子的自組裝是分子自發(fā)從無(wú)序變?yōu)橛行虻倪^(guò)程，依靠分子之間的電荷、氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵作用力實(shí)現(xiàn)。RADA16-I[Ac(RADA)4CONH2]是一種合成的能自發(fā)組裝的離子互補(bǔ)型短肽，由帶正電精氨酸（R）、疏水丙氨酸（A）和帶負(fù)電的天冬氨酸（D）交替周期性重復(fù)合成的，通過(guò)電荷的相互作用形成三維水凝膠，其含水量可達(dá)到 99% 以上[2]。RADA16-I水凝膠具有以下優(yōu)點(diǎn)：成型方便；體內(nèi)低細(xì)胞毒性、高生物相容性；纖維直徑 7 ～ 10 nm，空隙直徑 50 ～ 200 nm，類似天然細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供三維納米結(jié)構(gòu)環(huán)境；黏彈性好，與腦、脊髓和神經(jīng)模量相接近[3-4]。研究表明，由 RADA16-I 制備的三維納米纖維網(wǎng)絡(luò)能夠促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)突觸的形成，對(duì)于腦修復(fù)、軸突再生以及周圍神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)具有積極作用[5]。RADA16-I 可以通過(guò)固相合成法進(jìn)一步用各種有生物活性的功能片段加以修飾，將 RADA16-I 作為小分子或蛋白質(zhì)的載體，實(shí)現(xiàn)可控的分子釋放。由于 RADA16-I溶液酸性很強(qiáng)，成膠之前 pH 為 3 ～ 4，直接接觸可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)，因此植入體內(nèi)之前需要將 pH 調(diào)到中性[6]。另外，RADA16-I 水凝膠中缺乏細(xì)胞外基質(zhì)中的各種生長(zhǎng)因子和活性蛋白，生物活性有限，對(duì)其進(jìn)行改性，即接枝功能化片段合成功能化自組裝多肽（fSAP），可以改善其強(qiáng)酸性的缺點(diǎn)，并且經(jīng)過(guò)活性片段修飾的多肽分子自組裝后，活性片段可以暴露在水凝膠的表面，賦予多肽材料一定的生物學(xué)活性，從而提高自組裝多肽水凝膠的作用[7-8]。研究較多的活性片段包括層黏連蛋白來(lái)源的 IKVAV，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）來(lái)源的 RGI，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）來(lái)源的 KLT，以及 BMHP1、BMHP2 等。

將功能化多肽分子 K LT 與同濃度的RADA16-I 水溶液等體積混合制備功能化自組裝多肽水凝膠，在水凝膠上進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的二維和三維培養(yǎng)，結(jié)果表明 KLT 多肽片段有利于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和遷移，具有促血管生成的潛能[9]。將有生物活性的短肽片段 IKVAV（Ile-Lys-Val-Ala-Val）序列和 RGD（Arg-Gly-Asp）序列接枝到 RADA16-I 上，RGD序列與軸突生長(zhǎng)高度相關(guān)，IKVAV 能選擇性地促進(jìn)神經(jīng)元方向的分化和細(xì)胞黏附，而抑制膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化和黏附；將這兩種功能化自組裝多肽制備成混合的三維水凝膠，用于修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)5 mm 缺損，結(jié)果表明，接枝功能化片段的水凝膠在促進(jìn)軸突再生和雪旺細(xì)胞遷移上效果比單純RADA16-I 水凝膠更好，證明了功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠為周圍神經(jīng)再生提供了更好的微環(huán)境。

本文用模擬神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）和 BDNF 功能的多肽片段修飾 RADA16-I，得到功能化自組裝多肽，該多肽能夠在培養(yǎng)基環(huán)境中自組裝成水凝膠，具有類似細(xì)胞外基質(zhì)的微觀形貌。將該水凝膠用于神經(jīng)類細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果表明其具有良好的生物相容性，兩者的協(xié)同作用能夠明顯促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。

表 1 實(shí)驗(yàn)所用多肽Table 1 List of peptides

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 SD 乳鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供；實(shí)驗(yàn)用自組裝多肽均由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；離心管、培養(yǎng)瓶、24 孔培養(yǎng)板均購(gòu)自美國(guó) Corning 公司；細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM、胎牛血清 FBS 購(gòu)自Gibco 公司；NB4 型膠原酶購(gòu)自美國(guó) Serna 公司；0.25% 胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；PBS、4%多聚甲醛、封閉山羊血清、Triton X-100 購(gòu)自中國(guó)Solarbio 公司；小鼠來(lái)源 S100 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；山羊抗小鼠單克隆抗體 Alexa 488購(gòu)自美國(guó) Novus 公司；DAPI 染色液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；羅丹明鬼筆環(huán)肽購(gòu)自美國(guó)Cytoskeleton 公司。

1.1.3 細(xì)胞株及培養(yǎng)基 大鼠 PC12 細(xì)胞系購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；馬血清、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；神經(jīng)生長(zhǎng)因子購(gòu)自舒泰神（北京）制藥有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Chirascan-plus 型圓二色光譜儀為英國(guó) Applied Photophysis 公司產(chǎn)品；Dimension icon 原子力顯微鏡為德國(guó) Bruker 公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡（SEM）為德國(guó) Zeiss 公司產(chǎn)品；LSM710 型共聚焦顯微鏡為德國(guó) Leica 產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 自組裝多肽水凝膠的制備 實(shí)驗(yàn)所用多肽及來(lái)源如表 1 所示，均由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司使用多肽固相合成法合成，經(jīng)過(guò)高效液相色譜法分析，純度均大于 90%。將合成的多肽粉末以10 mg/ml 的濃度溶于超純水中，用超聲探針超聲水溶液2 min，使粉末完全溶解。隨后用一次性濾器進(jìn)行過(guò)濾滅菌。將兩種功能化多肽分別與 1% 的RADA16-I 溶液按照 1∶1 的體積比混合，得到RAD/RGI 和 RAD/CTD 溶液。將兩種功能化多肽和 RADA16-I 按照 2∶1∶1 的體積比混合，得到RAD/CTD + RGI 溶液。

取出無(wú)菌培養(yǎng)容器放入 24 孔板中，向孔板中加入 DMEM 培養(yǎng)基將培養(yǎng)容器底部的膜潤(rùn)濕，然后小心地將 4 種自組裝多肽溶液 RAD、RAD/CTD、RAD/RGI 和 RAD/CTD + RGI 分別加入到培養(yǎng)容器中，再加入 100 μl 培養(yǎng)基，放入37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中 30 min 后將孔板中培養(yǎng)基換成新的培養(yǎng)基，重復(fù) 3 ～ 4 次，孵育過(guò)夜。即可得到多肽水凝膠。

1.2.2 圓二色譜（CD）分析 將配制好的 1%RADA16-I、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD +RGI 自組裝多肽溶液用超純水稀釋 100 倍，各取200 μl 放入樣品槽中，選擇路徑長(zhǎng)度為 1 mm，波長(zhǎng)范圍 190 ～ 260 nm。

1.2.3 原子力顯微鏡（AFM）觀察 將配制好的1% RADA16-I、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD+ RGI 自組裝多肽溶液用超純水稀釋 100 倍，各取 10 μl 稀釋液滴加到新鮮的云母片上，然后用100 μl 超純水沖洗。將云母片自然晾干后用原子力顯微鏡觀察。

1.2.4 掃描電鏡（SEM）觀察 將制備好的自組裝多肽水凝膠分別在 2.5% 的戊二醛溶液中固定過(guò)夜，采用乙醇梯度濃度（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）逐級(jí)脫水，每個(gè)濃度 30 min。隨后使用 CO2臨界點(diǎn)干燥儀將脫水后的樣品干燥。將干燥好的樣品通過(guò)導(dǎo)電膠粘在樣品臺(tái)上，通過(guò)真空濺射的方法在樣品表面均勻鍍上一層金膜，采用 10 kV 電壓對(duì)樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察并記錄。

1.2.5 雪旺細(xì)胞的三維培養(yǎng) 將出生 3 d 的 SD乳鼠處死，浸泡于醫(yī)用酒精中消毒，隨后在超凈臺(tái)中取出坐骨神經(jīng)，剝除坐骨神經(jīng)外膜，加入 1 ml NB4 型膠原酶，將神經(jīng)剪碎，在 37 ℃ 恒溫箱內(nèi)磁力攪拌 10 min，使組織消化完全，加入 DMEM/F-12（10% FBS）終止消化，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，恒溫箱中孵育 48 h。

種細(xì)胞前用 10%（W/V）的蔗糖溶液重懸雪旺細(xì)胞，將自組裝多肽溶液與濃度為 20%（W/V）的蔗糖溶液以 2∶1 的比例混合均勻。迅速將 20 μl細(xì)胞懸液（500 000 個(gè)細(xì)胞）與 100 μl 含有蔗糖的自組裝多肽溶液混合均勻，緩慢加入到 24 孔板中已潤(rùn)濕好的無(wú)菌培養(yǎng)容器中，并加入雪旺細(xì)胞所用的培養(yǎng)基使自組裝多肽成凝膠。將孔板放入 37 ℃培養(yǎng)箱中 15 min，隨后將孔板中的培養(yǎng)基換成新的，再次放入培養(yǎng)箱中，30 min 內(nèi)置換 2 次，保證細(xì)胞處于合適的 pH 環(huán)境。培養(yǎng) 3 d 后，用 4%多聚甲醛固定 30 min，用 PBS 清洗 3 次，每次5 min，然后加入 0.3% Triton X-100 進(jìn)行透膜處理 5 min，隨后用 10% 山羊血清室溫下封閉 1 h。PBS 清洗 3 次后加入小鼠來(lái)源 S100 單克隆抗體（1∶200）放于 4 ℃ 過(guò)夜，吸走一抗后 PBS 洗3 遍，加入山羊抗小鼠單克隆抗體 Alexa 488（1∶200）室溫下孵育 1 h。PBS 清洗 3 遍后加入DAPI 染液對(duì)細(xì)胞核室溫下染色 5 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞情況。

1.2.6 水凝膠上 PC12 細(xì)胞的軸突生長(zhǎng) PC12細(xì)胞系在含有 10% 馬血清和 5% 胎牛血清的RPMI1640 中培養(yǎng)。將 PC12 細(xì)胞以 2.5 × 104個(gè)細(xì)胞/水凝膠的密度接種在水凝膠 RAD、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD + RGI 上，然后在含 5%CO2的環(huán)境中于 37 ℃ 孵育 48 h 使細(xì)胞黏附。然后用 PC12 分化培養(yǎng)基（RPMI1640、1% 馬血清、50 ng/ml 神經(jīng)生長(zhǎng)因子）培養(yǎng) 3 d。之后，PC12細(xì)胞用羅丹明鬼筆環(huán)肽染色并通過(guò)共焦激光掃描顯微鏡成像。通過(guò) Image Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量不同組中軸突生長(zhǎng)的長(zhǎng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS 22 軟件處理與分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較運(yùn)用方差分析，兩兩比較運(yùn)用 Student'st檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自組裝多肽水凝膠的表征

在緩沖液中多肽片段自組裝形成柔軟的不透明水凝膠，其中 β 折疊在自組裝過(guò)程中起著重要作用。4 種自組裝多肽均顯示出典型的 β 折疊的色譜，在 195 nm 處有一個(gè)正峰，在 215 nm 處有一個(gè)負(fù)峰，如圖 1 所示。功能化的自組裝多肽與純 RADA16-I 相比，表現(xiàn)出較小的峰，表明功能片段的加入降低了 β 折疊程度，原因是 RADA16-I是自組裝的主要片段，單獨(dú)的功能化片段不能自組裝成水凝膠。

圖 1 不同自組裝多肽的圓二色譜Figure 1 CD spectra of different self-assembling peptide

圖 2 掃描電鏡觀察自組裝多肽水凝膠的微觀形貌Figure 2 SEM microstructure of self-assembling peptide hydrogels

圖 3 原子力顯微鏡觀察自組裝多肽的纖維形貌Figure 3 AFM microstructure of self-assembling peptide hydrogels

表 2 不同自組裝多肽纖維直徑Table 2 Diameters of SAP nanofibers

圖 4 雪旺細(xì)胞在自組裝多肽水凝膠中的三維培養(yǎng)Figure 4 SCs cultured on self-assembling peptide hydrogels

掃描電鏡和原子力顯微鏡的結(jié)果表明，RADA16-I、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD +RGI 4 種自組裝多肽的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯差別，均形成納米尺度的纖維，如圖 2 和圖 3 所示。由于不同自組裝多肽的氨基酸數(shù)不同，因此自組裝得到的納米纖維的直徑也不同，如表 2 所示。RADA16-I 多肽水凝膠的纖維直徑最小，而RAD/CTD 的纖維直徑最大，這與它們的氨基酸數(shù)一致。SEM 結(jié)果還表明，這種納米纖維水凝膠具有類似細(xì)胞外基質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中孔的大小為 5 ～ 200 nm。

2.2 雪旺細(xì)胞在自組裝多肽水凝膠上的生長(zhǎng)

雪旺細(xì)胞與自組裝多肽溶液混合，通過(guò)三維培養(yǎng) 3 d 后，細(xì)胞形態(tài)如圖 4 所示。雪旺細(xì)胞在水凝膠中鋪展良好，說(shuō)明自組裝多肽水凝膠對(duì)神經(jīng)類細(xì)胞有良好的生物相容性，能夠?yàn)樯窠?jīng)類細(xì)胞提供適宜生長(zhǎng)的環(huán)境。

2.3 自組裝多肽水凝膠上 PC12 細(xì)胞軸突生長(zhǎng)情況

PC12 在不同自組裝多肽水凝膠上均有分化，圖 5 結(jié)果表明，與其他組相比，RAD/CTD + RGI可以誘導(dǎo)軸突更快生長(zhǎng)；此外，RAD/CTD 和RAD/RGI 組的平均軸突長(zhǎng)度高于 RAD 組，說(shuō)明功能化序列 CTDIKGKCTGACDGKQC 和RGIDKRHWNSQ 可以促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。并且這兩個(gè)功能片段的組合比單一組有更好的軸突生長(zhǎng)，進(jìn)一步證明了 CTDIKGKCTGACDGKQC 和RGIDKRHWNSQ 對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)的協(xié)同作用。

3 討論

外周神經(jīng)損傷修復(fù)中損傷神經(jīng)再生微環(huán)境的構(gòu)建十分重要，如果能為神經(jīng)細(xì)胞和組織提供適宜生長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，就能夠提高外周神經(jīng)的修復(fù)速度。模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境是材料設(shè)計(jì)的關(guān)鍵[10]。本研究通過(guò)固相合成法將模擬神經(jīng)因子 NGF 和BDNF 功能的多肽片段連接到 RADA16-I 自組裝多肽上，并與 RADA16-I 混合，得到具有良好物理性能和生物相容性以及促神經(jīng)功能的多肽水凝膠。該納米纖維水凝膠的微觀形貌與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相似，在體外與雪旺細(xì)胞和 PC12 細(xì)胞相容性良好，并且兩種功能化多肽協(xié)同可以加速PC12 軸突快速生長(zhǎng)。

在組織工程中，NGF 和 BDNF 被廣泛用于神經(jīng)修復(fù)，它們分別促進(jìn)感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的修復(fù)。然而，應(yīng)用外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子往往具有靶向性差、給藥困難、因子半衰期短的問(wèn)題。更重要的是，各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子都有其自身的作用，在組織工程中添加多種生長(zhǎng)因子是不現(xiàn)實(shí)的，這不僅會(huì)增加成本，而且會(huì)增加由于不適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子引起的癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而功能化的自組裝多肽片段可以避免這些問(wèn)題。首先，功能化片段在機(jī)制中具有可控的生物降解特征，隨著多肽水凝膠的降解而逐步釋放；其次，它們能發(fā)揮類似神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的功能，可以作為因子的有效替代物。因此，我們使用兩種新型的功能化自組裝多肽 CTD 和 RGI 分別模擬NGF 和 BDNF 的功能。

總之，我們通過(guò)向 RADA16-I 連接CTDIKGKCTGACDGKQC 和 RGIDKRHWNSQ（分別來(lái)自 NGF 和 BDNF）多肽片段合成功能化的自組裝多肽水凝膠。通過(guò)多種表征方法證明該自組裝多肽水凝膠具有類似細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維結(jié)構(gòu)，與神經(jīng)類細(xì)胞的生物相容性良好，并且兩者的協(xié)同作用能夠促進(jìn)軸突快速生長(zhǎng)。

圖 5 自組裝多肽水凝膠 RAD（A）、RAD/CTD（B）、RAD/RGI（C）和 RAD/CTD + RGI（D）上 PC12 細(xì)胞分化情況和軸突長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)（E）Figure 5 Neurite growth of PC12 cell on RAD (A), RAD/CTD (B), RAD/RGI (C) and RAD/CTD + RGI (D) hydrogels, the neurite length (E)