王浩，楊月峰，胡澤斌，王華，肖鳳君，王立生

乳腺癌是最為常見的女性惡性腫瘤之一，在美國，乳腺癌占女性癌癥死亡率的第二位；而我國乳腺癌的發(fā)病率位居女性癌癥發(fā)病率之首[1-2]。晚期乳腺癌患者往往會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。2015 年 10 月，美國 FDA批準了攜帶粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的單純皰疹溶瘤病毒上市，基因治療和溶瘤病毒治療成為腫瘤治療研究的熱點[3]。本實驗室長期從事溶瘤腺病毒的基礎(chǔ)研究，研發(fā)了多種溶瘤腺病毒載體[4-8]。其中，攜帶可溶性轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor β，TGF-β）受體 II-人IgGFc 融合蛋白（sTGFβRIIFc）的溶瘤腺病毒Ad.sT，可有效抑制乳腺癌（MDA-MB-231）骨轉(zhuǎn)移的進展[4]。但是，對于 sTGFβRIIFc 基因的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用與機制尚未做系統(tǒng)分析。

在具有完全免疫系統(tǒng)的乳腺癌細胞 4T1 移植瘤模型中，采用瘤內(nèi)給藥方式給予攜帶sTGFβRIIFc 基因的復(fù)制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT和對照病毒 Ad(E1-).Null 進行治療，明確Ad(E1-).sT 的治療效果；研究 Ad(E1-).sT 對小鼠血象的調(diào)控作用；分析 Ad(E1-).sT 對小鼠外周血T 淋巴細胞亞群和小鼠脾臟樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的激活效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 小鼠乳腺癌細胞 4T1 購自美國ATCC 公司，培養(yǎng)于 10% 胎牛血清（FBS）的 1640培養(yǎng)基中。

1.1.2 重組腺病毒 攜帶可溶性 TGF-β 受體 II-人 IgGFc 融合蛋白（sTGFβRIIFc）的復(fù)制缺陷型重組腺病毒 Ad(E1-).sT 和不攜帶外源基因的對照病毒 Ad(E1-).Null 均由本實驗室采用 Adeasy 系統(tǒng)制備獲得。大量擴增獲得的病毒原液，經(jīng)氯化銫密度梯度離心，獲得高質(zhì)量的病毒，其顆粒滴度大于 1 × 1012VPs/ml，純度（OD260/OD280）在 1.25 ～1.45 之間。

1.1.3 實驗動物 動物模型為小鼠皮下移植瘤模型，4 ～ 6 周齡、雌性、BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證編號為：SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院動物房。動物實驗方案和操作流程均經(jīng)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會批準并嚴格執(zhí)行。

1.1.4 主要試劑與儀器 APC 標記的大鼠抗小鼠 CD3e 抗體（APC-CD3e）、PE 標記的大鼠抗小鼠 CD4 抗體（PE-CD4）、FITC 標記的大鼠抗小鼠 CD8 抗體（FITC-CD8a）、FITC 標記的大鼠抗小鼠 CD11c 抗體（FITC-CD11c）和 PE 標記的大鼠抗小鼠 CD86 抗體（PE-CD86）均購自美國eBioscience 公司；紅細胞裂解液、流式細胞儀FACScalibur 均購自美國 BD 公司；血細胞計數(shù)儀購自華鑫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺癌細胞皮下移植瘤模型建立 對數(shù)生長期的小鼠乳腺癌細胞 4T1 經(jīng)胰酶消化、收集后，用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 次；將 4T1 細胞按照每只 BALB/c 小鼠 2 × 106個/100 μl PBS 的量進行皮下接種。檢測小鼠腫瘤生長情況，當小鼠腫瘤生長至綠豆大時進行治療。

1.2.2 Ad(E1-).sT 治療 4T1 移植瘤的療效評價 荷瘤后第 7 天，測定腫瘤體積，將成瘤小鼠按腫瘤體積進行隨機分組，分為 Buffer 治療組、Ad(E1-).Null 治療組和 Ad(E1-).sT 治療組，分別瘤內(nèi)給予 PBS（100 μl）、Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT（2.5 × 1010VPs/100 μl PBS）進行治療；荷瘤后第10 天，重復(fù)治療一次（病毒劑量同第一次）。第 7、12、15、19 天分別檢測腫瘤的體積，繪制腫瘤生長曲線；第 19 天，處死小鼠，剝離腫瘤并測定重量。

1.2.3 Ad(E1-).sT 治療對小鼠血象的影響 荷瘤后第 12 天和第 18 天，分別采用內(nèi)眥靜脈取血方式，收集抗凝的小鼠外周血 100 μl；取 20 μl 血樣，進行小鼠血象分析，分別測定小鼠淋巴細胞（W-SCC）、粒細胞（W-LCC）和中間細胞（W-MCC）的數(shù)量。

1.2.4 Ad(E1-).sT 治療對小鼠外周血 T 淋巴細胞亞群的影響 將收集的抗凝外周血 50 μl 標記APC-CD3e、PE-CD4 和 FITC-CD8a，室溫避光放置 30 min；加入 2 ml 1 × 紅細胞裂解液，室溫放置 10 min；離心收集細胞，并用 PBS 洗滌 2 次，收集細胞后，采用流式細胞術(shù)檢測 CD4+T 淋巴細胞和 CD8+T 淋巴細胞的比例。

1.2.5 Ad(E1-).sT 治療對小鼠脾臟中樹突狀細胞的影響 第 19 天，處死小鼠并剝離腫瘤后，收集小鼠脾臟；將脾臟剪碎并研磨后，過 70 μm 尼龍膜，離心收集細胞；加入 5 ml 1 × 紅細胞裂解液，37 ℃ 水浴放置 5 min，充分裂解紅細胞。收集細胞后，用 PBS 洗滌 2 次，進行細胞計數(shù)，計算脾臟細胞總數(shù)。

同時，取 5 × 106細胞標記 FITC-CD11c 和PE-CD86，室溫放置 30 min；收集細胞后，用 PBS洗滌 2 次，上機檢測。計算 CD11c+CD86+DC 的比例和數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用 Prism5.0 進行統(tǒng)計分析，以±s進行描述。腫瘤生長曲線采用兩因素重復(fù)測量的方差分析，并結(jié)合t檢驗進行兩兩比較；其他數(shù)據(jù)采用方差分析，并結(jié)合t檢驗進行兩兩比較。以P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜ 0.01 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Ad(E1-).sT 顯著抑制乳腺癌移植瘤的生長

在小鼠乳腺癌 4T1 移植瘤建立后，我們采用瘤內(nèi)給藥方式給予重組腺病毒 Ad(E1-).Null 和Ad(E1-).sT 進行治療。通過監(jiān)測腫瘤的體積，發(fā)現(xiàn)Ad(E1-).Null 對腫瘤生長無明顯抑制作用，而Ad(E1-).sT 則能夠有效抑制腫瘤的生長（圖 1A）。在治療終點（第 19 天），與 Ad(E1-).Null 相比，Ad(E1-).sT 治療可顯著抑制腫瘤重量的增加（圖1B）。

2.2 Ad(E1-).sT 治療動態(tài)調(diào)節(jié)小鼠外周血血象

Ad(E1-).sT 治療后，分別于第 12 天和第18 天監(jiān)測小鼠外周血的血象。結(jié)果顯示，第12 天，Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 治療可促進淋巴細胞和中間細胞的增殖；第 18 天，淋巴細胞的數(shù)量開始回落，提示大量病毒已被機體清除；但是，粒細胞和中間細胞的比例則大幅上升。此外，與Ad(E1-).Null 相比，Ad(E1-).sT 治療可以顯著降低淋巴細胞和中間細胞的數(shù)量，并輕微下調(diào)粒細胞的數(shù)量（圖 2）。結(jié)果表明，Ad(E1-).sT 可通過調(diào)節(jié)淋巴細胞和炎癥細胞的增殖，抑制炎癥反應(yīng)的過度激活，促進抗腫瘤免疫的形成。

圖 1 Ad(E1-).sT 抑制小鼠乳腺癌細胞 4T1 移植瘤的生長（A：腫瘤體積；B：腫瘤重量）Figure 1 Ad(E1-).sT inhibit the growth of mouse breast cancer xenograft (4T1) (A: Tumor volume; B: Tumor weight)

圖 2 Ad(E1-).sT 調(diào)節(jié)淋巴細胞和炎癥細胞的增殖（A：12 天；B：18 天）Figure 2 Ad(E1-).sT regulates the proliferation of lymphocytes and inflammatory cells (A: Day 12; B: Day 18)

2.3 Ad(E1-).sT 治療可促進小鼠外周血 CD4+T淋巴細胞的擴增

Ad(E1-).sT 治療后，于第 12 天分析了小鼠外周血中淋巴細胞的亞群。結(jié)果顯示，腫瘤細胞荷瘤，小鼠外周血中出現(xiàn)大量未成熟的 T 淋巴細胞（CD3+CD4-CD8-）。Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 治療可以減少未成熟 T 淋巴細胞的比例，同時增加CD4+T 淋巴細胞和 CD8+T 淋巴細胞的比例。其中，Ad(E1-).sT 可促進 CD4+T 淋巴細胞的擴增，而且其調(diào)節(jié)作用強于 Ad(E1-).Null（圖 3）。上述結(jié)果表明，Ad(E1-).sT 可以通過促進 CD4+T 淋巴細胞的擴增，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

2.4 Ad(E1-).sT 治療促進小鼠脾臟 DCs 的擴增與成熟

第 19 天，處死小鼠后，分離獲得了脾臟單細胞懸液，通過流式細胞術(shù)分析了 DCs 的比例與數(shù)量。結(jié)果顯示，Ad(E1-).Null 治療對脾臟 DCs 的比例和數(shù)量均無明顯的影響。Ad(E1-).sT 治療則可以有效提高 CD11c+CD86+的 DCs 細胞的比例，通過計數(shù)脾臟總細胞數(shù)，得到的 DCs 細胞總數(shù)也顯著提升（圖 4）。結(jié)合外周血中 T 淋巴細胞亞群的結(jié)果提示，Ad(E1-).sT 可能通過激活 CD4+T 淋巴細胞，進一步活化 DCs，從而形成特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖 3 第 12 天小鼠外周血 T 淋巴細胞亞群分析（A：CD4+T 淋巴細胞；B：CD8+T 淋巴細胞；C：CD4+ 與 CD8+T 淋巴細胞比例；*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）Figure 3 Analysis of subtypes of T lymphocytes in mouse peripheral blood on day 12 (A: CD4+T lymphocytes; B: CD8+T lymphocytes; C: Ratio of CD4+ to CD8+; *P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01)

圖 4 Ad(E1-).sT 治療促進脾臟 DCs 的活化（A：DC 細胞含量；B：DC 細胞總數(shù)；*P ＜ 0.05）Figure 4 Ad(E1-).sT therapy promotes activation of DCs in spleen (A: Dendritic cells content; B: Total dendritic cells; *P ＜ 0.05)

3 討論

TGF-β 為多功能的細胞因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著雙重作用：在腫瘤發(fā)生早期，TGF-β 可以通過 TGF-β/SMADs 信號通路抑制腫瘤的生長；而在腫瘤晚期，TGF-β 可通過多種途徑促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，例如，其可通過Scr/Fak/Akt 通路上調(diào) VEGF 表達，促進血管生成；通過 PI3K/Akt/mTOR 通路上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）表達等[9-10]。研究表明，在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中，Smad-2 磷酸化普遍存在，表明 TGF-β 信號被激活。而 TGF-β 可誘導(dǎo)溶骨相關(guān)因子和轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達，如白細胞介素 11（interleukin-11，IL-11）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）等；而 PTHrP 可進一步誘導(dǎo) RANKL 的產(chǎn)生，促進破骨細胞分化，進而形成正反饋效應(yīng)，促進骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展[11-13]。自腺病毒治療腫瘤的方法問世以來，因為它具有靶向性好、安全性高、感染能力強等多種優(yōu)點，迅速成為腫瘤基因治療領(lǐng)域的熱點[14]。隨著研究的進一步深入，隨之出現(xiàn)了攜帶不同治療基因的重組腺病毒，它們既具備腺病毒的功能，同時又能夠發(fā)揮治療基因的作用，因此也具有更好的療效[15-16]。腺病毒是抗腫瘤治療中應(yīng)用非常廣泛的基因載體，可以攜帶多種治療基因，治療基因?qū)胂俨《局锌僧a(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤的作用。2012 年，歐盟批準了西方國家第一個基因治療藥物 Glybera 上市，成為基因治療的重要里程碑[17]。經(jīng)過 3 年的發(fā)展，美國食品藥品管理局（FDA）于 2015 年10 月批準了攜帶粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）單純皰疹溶瘤病毒（HSV-1）上市[18]，為腫瘤基因治療注入了強心劑。影響腫瘤基因治療療效的關(guān)鍵因素，包括載體系統(tǒng)和治療基因。重組腺病毒載體具有易制備、高滴度產(chǎn)品、安全性強、宿主范圍廣、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高等優(yōu)勢，在腫瘤基因治療的基礎(chǔ)和臨床研究中得到廣泛應(yīng)用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌及前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移模型中，通過 sTGFβRIIFc 阻斷 TGF-β 信號，可抑制SMAD2 和 SMAD3 磷酸化，而溶瘤腺病毒聯(lián)合sTGFβRIIFc 則有效抑制腫瘤骨轉(zhuǎn)移的進展[4,19-20]。

作為多功能細胞因子，TGF-β 在誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，TGF-β可調(diào)節(jié)多種免疫細胞的活性，進而抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的形成，主要包括：增強骨髓來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）在腫瘤局部的聚集；誘導(dǎo) CD4+T 細胞向 CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細胞（regulatory T cells，Tregs）分化；下調(diào)自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）和CD8+T 細胞表面 NKG2D 受體，減弱其細胞毒效應(yīng)等[21-22]。進一步研究證實，阻斷 TGF-β 信號可抑制 MDSCs 和 CD4+Foxp3+Tregs，促進 NK 細胞和細胞毒性 T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）的活性，增強干擾素 γ（interferon γ，IFNγ）的表達及分泌，進而激活抗腫瘤免疫反應(yīng)[23-25]。在前期研究中我們表明，攜帶 sTGFβRIIFc 的復(fù)制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT 能夠抑制乳腺癌（MDA-MB-231）骨轉(zhuǎn)移的生長，但在免疫缺陷小鼠中無法評價其免疫激活效應(yīng)[4,13]。因此，本課題建立了免疫完全的乳腺癌移植瘤模型，并對其免疫激活效應(yīng)進行了評價，結(jié)果表明 Ad(E1-).sT 能抑制 4T1 移植瘤的生長；減輕病毒與腫瘤生長引起的炎癥反應(yīng)；促進小鼠外周血 CD4+T 淋巴細胞的增殖和小鼠脾臟 DCs 的擴增。本研究完善了溶瘤腺病毒聯(lián)合 sTGFβRIIFc 治療骨轉(zhuǎn)移的作用機制，有助于推動其臨床應(yīng)用。