張昕　任文君

摘 要：為探討不同持續(xù)時間有氧訓(xùn)練對大鼠骨骼肌和血清中NO生成的影響及分子機制，隨機把40只雄性SD大鼠分為4組（n=10）：對照組、2周訓(xùn)練組、4周訓(xùn)練組和6周訓(xùn)練組，采用Griess法測定股四頭肌和血清NO含量，采用試劑盒測定總一氧化氮合酶（NOS）活性和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活性，采用實時定量PCR測定各型一氧化氮合酶及microRNA-24的表達。結(jié)果表明：與對照組相比，隨著運動時間的增加，實驗組骨骼肌和血清中NO含量明顯增加，差異顯著（P<0.05，P<0.01），在訓(xùn)練第4周達到最大，并且不隨訓(xùn)練時間延長而增加；有氧訓(xùn)練后，股四頭肌microRNA-24的表達水平顯著升高；有氧訓(xùn)練引起cNOS的活性和eNOS mRNA的表達均顯著升高（P<0.05，P<0.01），而iNOS的變化不顯著?？梢哉J為：有氧運動可通過上調(diào)microRNA-24的水平，上調(diào)eNOS的表達和活性，從而增加NO生成量。這可能是有氧運動調(diào)節(jié)eNOS表達的機制之一。

關(guān)鍵詞：有氧訓(xùn)練；骨骼??；NO；NOS；miR-24

中圖分類號：G 804.2 學(xué)科代碼：040302 文獻標(biāo)識碼：A

Abstract：To elucidate the effects of aerobic exercise on the production of NO and the mechanism that regulate the expression of NOS，40 male SD rats were separated into control group and training group for 2 weeks， training group for 4 weeks，training group for 6 weeks，n=10. The levels of NO in quadriceps and serum were detected by Griess method，and the activity of NOS in quadriceps was detected by nitrix oxide synthase detection kit，the expression of different types of NOs and microRNA-24 was detected by RT-qPCR. Results： To compare with control group，NO production was elevated significantly in both quadriceps and serum in aerobic exercise groups（p<0.05， p<0.01）and approach the peak point after 4 weeke exercise，and maintained in the same levels even suatained exercise for longer time. Both total NOS and cNOS activity were enhanced in quadriceps，but aerobic exercise had no effects on the activity of iNOS. Aerobic exercise significantly increased the expression of eNOS and microRNA-24（p<0.05， p<0.01）. To sum up，aerobic exercise elevates the production of NO by upregulating the expression of eNOS. In addition，aerobic exercise down-regualtes the expression of microRNA-24， which maybe the reason why aerobic exercise can enhance the activity of eNOS.

Keywords：aerobic training；skeletal muscle； nitric oxide； nitric oxide synthase；miR-24

一氧化氮（NO）是在一氧化氮合酶（NOS）的催化作用下，由L-精氨酸與活性氧分子作用而產(chǎn)生的活性分子。NO 可激活鳥苷酸環(huán)化酶，參與血管平滑肌的舒張、抑制血小板凝集、神經(jīng)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等多種生理過程[1]。近年來，NO在骨骼肌功能中的作用也受到越來越多的重視。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，NO可以通過調(diào)節(jié)肌肉供氧速度、營養(yǎng)物質(zhì)可用度、神經(jīng)體液因素等參與調(diào)節(jié)骨骼肌的運動功能[2] 。大量研究顯示：運動訓(xùn)練，特別是有氧訓(xùn)練，可顯著促進骨骼肌產(chǎn)生NO[2]。雖然有氧運動可促進骨骼肌產(chǎn)生NO這些現(xiàn)象已被廣泛證實，但是這一現(xiàn)象的分子機制仍不十分清楚，而揭示有氧運動上調(diào)NO生成的機制對于建立更科學(xué)的運動訓(xùn)練方法、闡明適量運動在醫(yī)學(xué)中的作用很有意義。

microRNA（miRNA）是長約21～25個核苷酸的單鏈小RNA，它通過與mRNA的3-UTR區(qū)結(jié)合來抑制mRNA的翻譯或者促進其降解，從而負性調(diào)控基因的表達[3]。miRNA廣泛存在于各種生物體中，它們通常在進化上是保守的，在細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生等多種生物過程中起作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)microRNA -24在心肌等組織中可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）的表達[4]，并且microRNA -24參與調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的增殖和遷移，在骨骼肌的損傷修復(fù)和收縮等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。在運動過程中，microRNA -24是否可調(diào)節(jié)骨骼肌中一氧化氮合酶的活性，仍不明確。

本文研究不同的有氧運動時間對于大鼠股四頭肌中NO的水平及microRNA-24的表達影響，為進一步了解有氧運動上調(diào)NO生成的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 訓(xùn)練與取材

健康雄性Spraque Dawley（SD）大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g（實驗所用大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供），自由攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組10只大鼠，分組情況見表1。

采用運動強度逐步遞增的訓(xùn)練方式進行跑臺運動訓(xùn)練，起始速度為15 m/min，時間為20 min，運動負荷參考Bedford的研究[5]。對照組正常籠內(nèi)飼養(yǎng)，不運動；有氧訓(xùn)練組訓(xùn)練5 d/周，遞增速度為3 m/min，時間為5 min，運動至速度為20 m/min，時間為60 min后增加跑臺坡度至10%，整個訓(xùn)練過程可用電刺激來強迫大鼠進行跑臺訓(xùn)練（電刺激強度小于1 mA）。分別訓(xùn)練2周、4周、6周之后，處死大鼠，分離股四頭肌，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑

一氧化氮合酶分型試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）；Trizol（Invetrogen公司，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，美國）；引物由華大生物科技有限公司合成；SYBR Green Master（Roche公司，瑞士）。

1.3 實驗方法

1.3.1 一氧化氮測定

取股四頭肌制備組織勻漿，用BCA試劑盒測定組織勻漿中蛋白的濃度。采用Grise法測定組織勻漿和血清中一氧化氮含量，即把鉻條剪為1 mm邊長的正方形，浸泡于0.2 mol/L的HCl活化，隨后取200 μL組織勻漿加入80 μL 375 mmol/L ZnSO3，100 μL 275 mmol/LNaOH，120 μL雙蒸水，震蕩混勻，在1 0 000 g離心30 min，去除蛋白質(zhì)沉淀，取上清；把干燥的鉻粒浸泡于5 mmol/L甘氨酸緩沖液配制的CuSO3，震蕩鍍銅10 min；取100 μL去蛋白的組織勻漿上清，加入100 μL甘氨緩沖液，150 mg鍍銅鉻粒，震蕩2 h還原NO3-。取等體積10 % N-1-萘乙二胺與1 %磺胺混勻，配制Griess試劑。取96孔酶標(biāo)板，孔中加入100 μL被還原的組織勻漿上清與等體積的Griess試劑，在室溫顯色90 min。在544 nm波長測定光吸收。

1.3.2 一氧化氮合酶活力測定

按照南京建成生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的一氧化氮合酶分型試劑盒測定組織勻漿中總的一氧化氮合酶活力與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活力及組成型一氧化氮合酶活力。

1.3.3 RT-qPCR檢測一氧化氮合酶表達

采用Trizol 法提取總 RNA：取重量為100 mg的股四頭肌放入1.5 mL的無RNA酶EP管中，加入1 mL trizol，用組織勻漿器進行勻漿，隨后加入200 μL氯仿，混勻，在12 000 r/min離心20 min，取上清，加入等體積異丙醇，混勻，在12 000 r/min離心20 min，棄上清，用75 %的乙醇洗滌沉淀，用20 μL DEPC水溶解沉淀，即獲得總RNA溶液。用微量核酸蛋白定量儀定量后，取1 μg的總RNA，用olig dT引物反轉(zhuǎn)總mRNA，反轉(zhuǎn)的程序為oligdT引物1 μL，RNA 1 μg，用DEPC水把體積補充到12 μL；65 ℃保溫5 min后，立即冷卻，隨后加10×Buffer 4 μL、dNTPs 2 μL，RNA inhibitor 1 μL，AMV 1 μL，混勻，42 ℃ 作用1 h后，70 ℃ 5 min終止反應(yīng)。以cDNA 為模板進行RT-qPCR 的擴增，檢測內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）、神經(jīng)一氧化氮合酶（nNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達水平。擴增條件為：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s， 72 ℃ 30 s，45個循環(huán)。從美國國立生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)庫獲得人eNOS、nNOS、iNOS及β-actin的mRNA序列，應(yīng)用軟件oligo6.65設(shè)計RT-qPCR 擴增的引物，引物序列見表 2。

1.3.4 檢測mir-24 的表達

以莖環(huán)引物反轉(zhuǎn) mir-24，取cDNA 2.5 μL，分別加入上下游引物各1 μL，加入SYBR Green 12.5 μL，加入無菌水把體積補充至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共進行40個循環(huán)。以u6作為mir-24表達分析的內(nèi)參。見表3和表4。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（？字±s）表示。經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析進行多組間比較，以P <0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肌肉組織勻漿一氧化氮及血清一氧化氮水平的變化

與正常對照組相比，有氧訓(xùn)練組大鼠血清一氧化氮及股四頭肌組織勻漿中一氧化氮的水平顯著高于正常對照組大鼠；并且隨訓(xùn)練時間的延長進一步升高，在第4周達到最大。此后，即使繼續(xù)延長訓(xùn)練時間，一氧化氮的水平也不會進一步升高，如圖1所示。

2.2 肌肉組織中不同亞型一氧化氮合酶活力的測定

經(jīng)過有氧訓(xùn)練，股四頭肌一氧化氮合酶的活力顯著升高。與正常對照組相比，訓(xùn)練2周組的組織勻漿總一氧化氮合酶活性顯著升高，并隨著訓(xùn)練時間延長活力進一步升高，在訓(xùn)練4周達到最高，即使再進一步延長訓(xùn)練時間到6周，相比訓(xùn)練4周組，訓(xùn)練6周組酶活力沒有進一步增加，如圖2所示。在訓(xùn)練過程中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活力沒有顯著改變；相反，組成型的一氧化氮合酶的活力在有氧訓(xùn)練中顯著升高，如圖2所示。

2.3 各型一氧化氮合酶在組織中的表達

2周有氧訓(xùn)練后，股四頭肌中eNOS的表達水平顯著升高，但是隨訓(xùn)練時間的延長，eNOS的表達在訓(xùn)練4周達到最高，繼續(xù)延長訓(xùn)練時間到訓(xùn)練6周不會引起eNOS表達的進一步升高；而iNOS和nNOS表達水平則無顯著改變，如圖3所示。

2.4 股四頭肌中microRNA-24表達水平的改變

與對照組相比，有氧訓(xùn)練后，股四頭肌中microRNA-24的表達水平顯著升高。但是隨訓(xùn)練時間的延長，microRNA-24的表達水平并未進一步升高。訓(xùn)練6周后，microRNA-24的表達與訓(xùn)練4周組無顯著的差別。這表明短時間的有氧訓(xùn)練即可引起 microRNA -24的表達升高，在訓(xùn)練4周達到最高水平，并隨著運動訓(xùn)練時間的延長而維持在最高水平。如圖4所示。

3 討論

大量研究顯示，運動對機體內(nèi)NO的含量產(chǎn)生影響，NO含量的變化與機體運動量、運動強度、訓(xùn)練水平等相關(guān)。運動訓(xùn)練會刺激NOS活性，促使NO及其終產(chǎn)物NOx生成增多。不同的運動強度和時間對NO生成的影響不同?？偟膩碚f，長期訓(xùn)練機體生成NO的基礎(chǔ)量比不訓(xùn)練的要高，運動員安靜時血漿NOx一含量要比普通人高20%～25%[6]。長期運動訓(xùn)練增加骨骼肌NO生成能力主要與長時間中等強度的有氧練習(xí)使NOS活性增高有關(guān)。一般認為耐力運動主要通過上調(diào)NOS的表達引起骨骼肌組織NO生成增加，從而提高骨骼肌的抗疲勞能力和收縮能力[7]。

eNOS是組成型NOS之一，它不僅與心血管的功能有關(guān)，也與骨骼肌線粒體的功能及生成有關(guān)[8-9]。一般認為，持續(xù)的運動訓(xùn)練可以改善運動員的肌群代謝機能，這也是訓(xùn)練可提高運動成績的原因之一。大量的研究顯示，eNOS對肌肉的代謝有重要的調(diào)節(jié)作用：下調(diào)eNOS表達水平可降低氧化磷酸化復(fù)合體的功能[10]，并減緩脂肪酸的β-氧化[8]；可上調(diào)骨骼肌eNOS表達[11-12]。因此，訓(xùn)練引發(fā)的eNOS表達改變可能是訓(xùn)練引發(fā)骨骼肌代謝改變的原因之一，也可作為評估肌肉代謝的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，有氧訓(xùn)練2周即可導(dǎo)致eNOS表達升高，而訓(xùn)練4周時eNOS表達升高即達到頂點，即使延長訓(xùn)練時間eNOS表達也不會繼續(xù)升高。由此可見，有氧訓(xùn)練時應(yīng)根據(jù)肌肉的生理狀態(tài)，合理安排訓(xùn)練時間，以便取得較好的訓(xùn)練效果，減輕運動員的疲勞。

目前，運動促進骨骼肌eNOS mRNA表達機制的研究主要集中在切應(yīng)力的調(diào)節(jié)方面[11-12]。研究者發(fā)現(xiàn)多種微小RNA（miRNA）在肌肉活動的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用，microRNA-24就是其中之一。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)， microRNA-24可促進成肌細胞的分化，上調(diào)肌細胞生成素、α-肌動蛋白和骨骼肌肌球蛋白重鏈表達，從而促進肌纖維生成。運動訓(xùn)練也可引起肌細胞生成素、α-肌動蛋白和骨骼肌肌球蛋白重鏈表達上調(diào)[14]，這是骨骼肌適應(yīng)訓(xùn)練而對生理狀態(tài)的調(diào)整。由此可以推測：microRNA-24參與了骨骼肌適應(yīng)外界訓(xùn)練刺激的過程。

NO生成增加也是骨骼肌適應(yīng)訓(xùn)練刺激的一個重要機制。而miRNA-24在NO的生成中也發(fā)揮了重要的作用，在心肌細胞中可上調(diào)eNOS的表達[4]，因此，miRNA-24可能對骨骼肌中NO的生成也會產(chǎn)生影響。本研究的結(jié)果也顯示，有氧運動可上調(diào)miRNA-24表達。結(jié)合miRNA-24對eNOS的表達調(diào)節(jié)，可推測miRNA-24可能通過上調(diào)eNOS表達促進NO生成。結(jié)果顯示，在有氧訓(xùn)練2周即可導(dǎo)致miRNA-24表達升高，而訓(xùn)練4周時miRNA-24表達升高即達到頂點，即使延長訓(xùn)練時間miRNA-24表達也不會繼續(xù)升高。訓(xùn)練引發(fā)的miRNA-24改變與eNOS表達的改變趨勢是相同的。由此可見，訓(xùn)練引發(fā)的miRNA-24變化很可能是導(dǎo)致骨骼肌eNOS變化的原因。

通過本研究，可以看到有氧運動不僅可影響骨骼肌中NO和NOS的表達，miRNA-24的表達水平也因有氧訓(xùn)練而改變，這表明miRNA-24與骨骼肌適應(yīng)訓(xùn)練刺激有關(guān)。由此，有氧運動可從基因組層次影響肌肉的機能，闡明miRNA-24在骨骼肌中的詳細作用通路將有助于理解運動的生理作用。

4 結(jié)論

1）有氧訓(xùn)練可提高體內(nèi)NO 的水平、股四頭肌中組成型NOS的活力和eNOS的表達水平；并且在訓(xùn)練4周時，組成型NOS的活力和eNOS的表達達到頂點，即使延長訓(xùn)練時間NOS的活力和eNOS的表達也不會進一步升高。

2）有氧訓(xùn)練可提高股四頭肌中miRNA-24的表達水平；并且在訓(xùn)練4周時，組成型miRNA-24的表達達到頂點，即使延長訓(xùn)練時間miRNA-24的表達也不會進一步升高。這2個現(xiàn)象之間的生理邏輯是有氧運動通過上調(diào)miRNA-24表達改變肌肉組織中eNOS的表達和活力，進而通過改變體內(nèi)NO的水平來改變肌肉組織的代謝特點。

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