關(guān)亞飛，陳媛媛，馮年捷，周夢舟，汪超*，吳茜*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068;2.武漢市華測檢測技術(shù)有限公司，武漢 430223；3.湖北工業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院，武漢 430068)

原花青素也被稱為縮合單寧，是一種存在于植物中的多酚類化合物[1-6]。此外，原花青素還具有抗氧化性[7-10]、降脂降壓[11]、抗腫瘤[12,13]等生理活性。原花青素以黃烷-3-醇為單位，通過C4-C6或者C4-C8鍵連接而成，而C4-C8鍵和C4-C6連接方式出現(xiàn)的比率是3∶1。C4-C8連接而成的二聚體分別為B1，B2，B3，B4，C4-C6連接而成的二聚體分別為B5，B6，B7，B8，在8種異構(gòu)體中原花青素B2是活性最強(qiáng)的一個(gè)二聚體。近年來，金屬配合物的研究引起了眾多國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，而原花青素具有較高的超離域度，完整的大π鍵共軛體系，強(qiáng)配位的-OH基團(tuán)，和合適的空間構(gòu)型，故可作為金屬離子的良好配合配體。已有研究表明原花青素與Fe3+, Fe2+, Pb2+, Zn2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+等這些金屬離子形成配合物后的生物活性明顯增強(qiáng)[14-16]，這為天然產(chǎn)物的利用和開發(fā)提供了新思路。

因此，本研究選取了蓮原花青素和原花青素B2，探討了蓮原花青素金屬配合物，并對(duì)其金屬配合物進(jìn)行表征，同時(shí)分析了化合物抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，采用原花青素B2與金屬離子作用后進(jìn)行了研究，并推出了其配合物可能的結(jié)構(gòu)，旨在為原花青素的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

蓮原花青素：實(shí)驗(yàn)室提供；乙醇鈉、溴化鉀、六水合三氯化鐵、DPPH自由基、甲醇、甲酸、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、正己烷：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZabSpec高分辨磁質(zhì)譜儀 Waters公司；755B紫外可見分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；V-1700紫外掃描儀 日本島津公司；Thermo Nicolet Nexus 470 FT-IR光譜儀；DF-101磁力攪拌器 上海東璽制冷設(shè)備儀器有限公司；CHIUST BETA 2-8 LO真空冷凍干燥機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1 蓮原花青素金屬配合物的合成

分別稱取蓮原花青素和過量金屬鹽配制成溶液，攪拌后將金屬鹽溶液滴加到蓮原花青素溶液中，充分混合后，用2%乙醇鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8，于70 ℃水浴中回流40 min，溶液中產(chǎn)生有色沉淀物。室溫下冷卻后過濾，用蒸餾水將濾紙上的沉淀洗滌出來，冷凍干燥即得。

1.3.2 蓮原花青素金屬配合物的紅外、紫外表征

取2 mg樣品，加入200 mg溴化鉀混勻，研磨、壓片。在紅外光譜儀中先對(duì)純溴化鉀薄片進(jìn)行背景掃描，然后再對(duì)含有樣品的溴化鉀薄片進(jìn)行掃描。紅外光譜條件如下：掃描頻率：32 次/s；掃面范圍：400～4000 cm-1。此外，用紫外可見吸收光譜觀察蓮原花青素金屬配合物的吸收和蓮原花青素金屬配合物的變化。

1.3.3 原花青素B2與Fe3+配合物的電噴霧質(zhì)譜分析

準(zhǔn)確稱取2.4276 mg原花青素B2溶于10 mL去離子水中，56.76 mg FeCl3·6H2O溶于1 L去離子水中，取上述溶液2∶1(原花青素/FeCl3)置于試管中，充分震蕩10 min，靜置30 min，待測。

質(zhì)譜條件：正離子掃描模式，流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，流速 200 μL/h，碎片電壓100 V，毛細(xì)管電壓4000 V，入口電壓為180 V，出口電壓為40 V，霧化壓力30 psi，干燥氣體溫度350 ℃，速度為5 L/min, 質(zhì)譜離子范圍100～2500 m/z。

1.3.4 原花青素B2與Fe3+反應(yīng)后清除DPPH能力

分別配制1.5×10-3mol/L的原花青素B2和0.5×10-3mol/L的Fe3+溶液，按一定比例分別加入原花青素B2和Fe3+溶液，定容至2 mL，混勻后靜置30 min，再分別向試管中加入60 mg/L的DPPH乙醇溶液2 mL，混勻后，在室溫避光反應(yīng)30 min后于517 nm處測其吸光度，記作A1；以不加樣品時(shí)的吸光度值為對(duì)照，記作A2；以待測樣品和DPPH溶液溶劑(乙醇)的混合物的吸光度值為空白，記作A0。平行操作3次，取平均值，公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 配合物的物理性質(zhì)

表1 蓮原花青素金屬配合物的物理性質(zhì)Table 1 The physical property of LSPC-M

由表1可知，蓮原花青素與金屬離子形成的配合物溶解性都比較差，但是在加入金屬離子到蓮原花青素溶液中后，溶液立刻發(fā)生了顏色變化，推測是因?yàn)樾纬闪伺浜衔?，因此用此溶液進(jìn)行紫外表征分析。

2.2 蓮原花青素金屬離子配合物紅外表征

圖1 不同LSPC金屬配合物以及LSPC的紅外光譜圖Fig.1 The infrared spectrogram of different metalcomplexes of LSPC and LSPC

注：A為LSPC；B為Fe3+；C為Fe2+；D為Cu2+；E為Zn2+；F為Ca2+；G為Pb2+；H為Mn2+。

2.3 紫外分析

圖2 不同LSPC金屬配合物紫外光譜圖Fig.2 The ultraviolet spectrogram of different metal complexes of LSPC

注：A為Fe3+；B為Fe2+；C為Ca2+；D為Cu2+；E為Pb2+；F為Zn2+；G為Mn2+。

表2 原花青素與金屬離子鰲合后最大吸收峰Table 2 The maximum absorption peak after the coupling of procyanidins with melalions

由圖2和表2可知，在金屬離子存在的條件下，LSPC的最大吸收波長和吸收強(qiáng)度都發(fā)生了改變，或增強(qiáng)或減弱。這可能是因?yàn)檫@些金屬離子可與樣品發(fā)生配合而導(dǎo)致溶液吸收光譜發(fā)生變化[17]。其中在Fe3+，F(xiàn)e2+，Cu2+，Mn2+和Pb2+離子存在下，蓮原花青素的紫外光譜圖變化最大，溶液顏色也發(fā)生明顯變化。而蓮原花青素在50 mg/L以內(nèi)Zn2+離子存在的條件下，最大吸收峰和吸收強(qiáng)度變化都不大，當(dāng)Zn2+濃度增加到100 mg/L以上時(shí)開始有明顯的變化。在Ca2+存在的條件下，溶液吸收強(qiáng)度降低，但隨著Ca2+的增加，吸收強(qiáng)度增加。提示蓮原花青素與金屬離子發(fā)生了配合作用。

眾多的酚羥基(助色團(tuán))是影響蓮原花青素紫外吸收的主要因素，蓮原花青素的A環(huán)和B環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)，使它的λmax出現(xiàn)在波長較大處(200～300 nm)，吸收強(qiáng)度最大。盡管蓮原花青素在加入金屬離子后，其最大吸收波長和吸收強(qiáng)度不同。蓮原花青素金屬化合物在紫外光區(qū)仍有明顯的酚羥基吸收，故仍具有蓮原花青素的抗氧化、消除自由基、抗衰老等生物活性[18]。同時(shí)，也進(jìn)一步證明了蓮原花青素與金屬離子反應(yīng)的進(jìn)行。

2.4 原花青素B2與Fe3+配合物的電噴霧質(zhì)譜

本文采用電噴霧電離(ESI)軟電離技術(shù)，研究了LSPC與金屬離子配合的方式，結(jié)果見圖3。

圖3 原花青素B2與Fe3+配合物的MS譜圖Fig.3 MS spectra of procyanidin B2-Fe3+complexes

圖中質(zhì)譜條件為ESI正離子模式，碎片電壓為100 V, 毛細(xì)管電壓為4000 V，入口電壓為180 V，出口電壓為40 V,霧化壓力為30 psi, 干燥氣體溫度為350 ℃，質(zhì)譜范圍為100～2500 m/z。

對(duì)應(yīng)的單荷m/z[(M+H)+]峰為579.1522的[B2+H]+，對(duì)應(yīng)電荷m/z[(M+H)2+]峰分別為606.1099的[2B2+Fe]2+、633.0691的[2B2+2Fe-2H]2+和895.1738的[3B2+Fe]2+，由此可以看出，原花青素B2與Fe3+的結(jié)合方式分別是1∶1，2∶1，3∶1以及原花青素B2與金屬離子結(jié)合的結(jié)構(gòu)式(見圖4)。

圖4 原花青素B2的結(jié)構(gòu)式及原花青素B2與Fe3+按1∶1，2∶1，3∶1配合可能的分子結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of procyanidin B2and possible structure of procyanidin B2-Fe3+(1∶1，2∶1，3∶1) complexes

2.5 原花青素B2與Fe3+反應(yīng)后清除DPPH能力

圖5 不同比例原花青素B2和Fe3+對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5 Clearance effects of different ratios of procyanidin B2and Fe3+on DPPH radical

由圖5可知，加入少量金屬離子后，原花青素B2清除DPPH·的能力增強(qiáng)，當(dāng)Fe3+與原花青素B2摩爾比為1∶2時(shí)，其清除DPPH能力最強(qiáng)，隨著金屬離子的加入，清除DPPH自由基能力逐漸減弱。

3 討論

本文以蓮原花青素作配位體，與7種金屬離子反應(yīng)，合成了7種蓮原花青素配合物，對(duì)蓮原花青素及金屬離子配合物紅外光譜分析的結(jié)果表明：與金屬離子發(fā)生配合的部位可能是蓮原花青素A環(huán)或B環(huán)上的鄰苯二酚基團(tuán)，蓮原花青素金屬配合物保留了蓮原花青素的基本骨架結(jié)構(gòu)，仍然存在酚羥基的吸收。因此，蓮原花青素金屬配合物能夠提供氫，仍然具有抗氧化、消除自由基、抗衰老等生物活性。加入金屬離子后，蓮原花青素的最大吸收峰和吸收強(qiáng)度都發(fā)生了變化，但是在紫外光區(qū)仍有明顯的吸收，說明有金屬離子存在的蓮原花青素仍具有抗氧化、消除自由基、抗衰老等生物活性。此外，探究了原花青素B2與Fe3+的結(jié)合方式，其結(jié)合方式分別為1∶1，2∶1，3∶1。與金屬離子反應(yīng)后，其清除DPPH自由基能力增強(qiáng)，而Fe3+與原花青素B2的摩爾比為1∶2時(shí)，其清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)。