沙繼斌 張靜 隋波 張成崗

1山東體育學院運動與健康學院（濟南 250102）2軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所（北京 100850）3蘇州大學體育學院（蘇州 215021）

近些年來肥胖與腸道菌群之間的關(guān)系逐漸得到證實。有研究表明，腸道菌群可有效調(diào)控宿主的代謝尤其是脂代謝，腸道菌群的平衡/失衡與宿主肥胖表型改變直接相關(guān)[1-4]。Cani等認為腸道菌群失衡所致內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）分泌增多是導致肥胖發(fā)生的重要誘因[5，6]。趙立平等則認為腸道菌群與肥胖之間的關(guān)系不僅密切相關(guān)，還可能存在因果關(guān)系[7-9]，腸道菌群尤其是特定菌種的改變可能是誘發(fā)動物及人體肥胖表型改變的直接誘因。Clarke等研究表明，運動可以顯著提高腸道菌群的多樣性，降低運動員體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[10]。已知有氧運動可有效促進脂肪的消耗，由此提示有氧運動同樣可能通過增加菌群多樣性，下調(diào)腸內(nèi)炎性因子水平等來實現(xiàn)減脂控體重。目前有氧運動對肥胖個體腸道菌群影響的研究報道較少，其機制尚不清楚。

多種人體不能消化吸收的復合多糖在進入大腸后，可有效促進腸道內(nèi)益生菌增殖，產(chǎn)生具有顯著抗炎效應(yīng)的短鏈脂肪酸[11]。由此推測復合多糖可能通過增加有益菌數(shù)量、抑制有害菌數(shù)量來調(diào)節(jié)失衡的腸道菌群，進而降低體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而實現(xiàn)減脂控體重。前期研究發(fā)現(xiàn)高脂膳食誘導肥胖大鼠體重、Lee's指數(shù)及脂肪系數(shù)均有明顯上升，有氧運動、復合多糖灌胃及二者的聯(lián)合干預均可減重、減脂；高脂膳食誘導大鼠肥胖過程中同步伴有血脂代謝紊亂，炎癥反應(yīng)顯著加?。欢醒踹\動、復合多糖灌胃及二者的聯(lián)合干預均可使血脂代謝改善，炎性因子水平顯著降低；提示上述不同干預措施均能通過有效抗炎及改善血脂代謝以改變動物身體成分[12]。本研究在上述已知動物表型改變的基礎(chǔ)上，同步分析上述干預措施對高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道菌群的影響，為進一步確證腸道菌群失衡可誘導肥胖發(fā)生的作用機理，尋求有效的減脂控體重措施提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 高脂膳食誘導肥胖動物模型建立及動物分組

健康雄性SD大鼠70只，體重117±15.4 g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（軍）2007-004。隨機選取10只作為對照組，飼喂普通飼料；剩余60只飼以高脂飼料D12492，許可證號：SCXK（京）2014-0008，4周后參照劉利民、王從容等的研究結(jié)果[13，14]，選擇體重大于對照組平均體重20%的大鼠作為肥胖大鼠，造模成功率約為70%。

選取造模成功的40只大鼠，將其隨機分為肥胖對照組、有氧運動組、復合多糖干預組、有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預組，每組10只。

1.2 實驗動物干預方案

1.2.1 有氧運動方案：依據(jù)陳文鶴等[15]研究結(jié)果選擇中等強度跑臺訓練，跑臺坡度0，初始速度自10 m/min開始，依次按照2.5 m/min速度遞增，每級持續(xù)5 min，以此模式遞增至15 m/min并維持此運動負荷，60 min/day，每周訓練6天，共訓練6周。每日定時按設(shè)定運動負荷對大鼠進行跑臺訓練。

1.2.2 復合多糖灌胃方案：以0.9%生理鹽水將復合多糖（編號：ss0627）配制為濃度10%的溶液，以動物體重的0.5%作為灌胃劑量，于每日下午定時對大鼠進行灌胃干預，共持續(xù)6周。其余各組代以等量生理鹽水。

1.3 腸道菌群樣本取材

用10%水合氯醛（10 ml/kg劑量）腹腔注射麻醉大鼠，于結(jié)腸末端留取糞便2顆，置于-80℃超低溫冰箱凍存，用于腸道菌群16S rDNA測序。

1.4 腸道菌群樣本DNADNA的提取及1616S rDNA rDNA測序

1.4.1 腸道菌群樣本DNADNA提取

使用糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型DP328）進行提取，使用紫外分光光度計測定所提取DNA的OD260/OD280比值，將質(zhì)量檢測合格的DNA置于-80℃冰箱凍存待測。

1.4.2 1616S rDNA rDNA的擴增

對腸道菌群16S rDNA的V4區(qū)進行PCR擴增，上游引物序列：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'；下游引物序列：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；PCR擴增結(jié)束后，從每個樣品中吸取100 ng（體積約5～10 μl）的PCR擴增產(chǎn)物，將每20個樣品作為一個批次進行混樣，充分混勻后濃縮體積至30 μl，2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行純化。

1.4.3 建庫、上機測序及質(zhì)控

利用美國Illumina公司的TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒完成建庫[16]。使用熒光分光光度計對文庫定量并通過Agilent高敏度核酸定量儀對PCR富集片段行質(zhì)量監(jiān)控并驗證DNA文庫；在Illumina MiSeq高通量測序平臺上采用雙末端測序法上機測序。

使用QIIME軟件（V1.6.0，http：//qiime.org/index.html）對下機數(shù)據(jù)進行預處理，包括：①數(shù)據(jù)拆分；②Tags拼接；③Tags截??；④Tags長度過濾；⑤Tags去嵌合體序列。最終得到高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)。所測得的每個OTUs的最長16S rDNA序列片段根據(jù)已有Greenbank數(shù)據(jù)庫進行相似性比對（網(wǎng)址：http：//greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

1.5.1 生物信息學分析

1.5.1.1ReadsReads數(shù)篩選及質(zhì)控

對測序產(chǎn)生的序列采用FLASH軟件數(shù)據(jù)包行paired-end reads拼接，依據(jù)引物條形碼序列barcode定位于相應(yīng)樣本，對于測序質(zhì)量較低的數(shù)據(jù)予以去除[17]。采用QIIME軟件數(shù)據(jù)包行reads質(zhì)控來挑選符合要求的高質(zhì)量 reads，并去除低質(zhì)量reads[18，19]。

1.5.1.2OTUsOTUs分析

采用QIIME質(zhì)控器的操作命令將相似度大于97%的序列挑選出來并聚類為一個操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU），同時生成OTUs矩陣[20]。

1.5.1.3物種注釋

采用Ribosomal Database Project（RDP）軟件數(shù)據(jù)包對OTUs的最長16S rDNA序列片行相似同源性比對和種屬分類學鑒定[21]，數(shù)據(jù)庫參照Greenbank（網(wǎng)址：http：//greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）。統(tǒng)計各個樣品在細菌科（family）、屬（genus）、種（species）分類水平上的組成。

1.5.2 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，菌群分類數(shù)據(jù)組間差異采用秩和檢驗進行比較，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組別動物菌科分類水平上的腸道菌群豐度分布改變結(jié)果

如圖1所示，與對照組相比，肥胖對照組大鼠腸道內(nèi)瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）顯著增加（P＜0.05）；梭菌科（Clostridiaceae）、蘇黎世桿菌科（Turicibacteraceae）顯著降低（P＜0.05）。

干預后，與肥胖對照組相比，有氧運動組大鼠腸道內(nèi)產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）顯著增加（P＜0.05）；螺桿菌科（Helicobacteraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）顯著降低（P＜0.05）。與肥胖對照組相比，復合多糖干預組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、韋榮氏球菌科（Veillonellaceae）、蘇黎世桿菌科（Turicibacteraceae）顯著增加（P＜0.05）；脫硫弧菌科（Desulforibrionaceae）、螺桿菌科（Helicobacteraceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）顯著降低（P＜0.05）。與肥胖對照組相比，有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）顯著增加（P＜0.05）。

2.2 各組別動物菌屬分類水平上的腸道菌群豐度分布改變結(jié)果

如圖2所示，與對照組相比，肥胖對照組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）顯著下降（P＜0.05），蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）數(shù)量顯著下降（P＜0.01）。

干預后，與肥胖對照組相比，有氧運動組大鼠腸道內(nèi)阿克曼氏菌屬（Akkemansia）、別樣棒菌屬（Allobaculum）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、布勞特氏菌屬（Blautia）均顯著增加（P＜0.01）；羅斯拜瑞氏菌屬（Roseburia）、薩特氏菌屬（Sutterella）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）數(shù)量也有顯著上升（P＜0.05），普雷沃氏菌（Prevetella）數(shù)量有增加，無顯著性差異。與肥胖對照組相比，復合多糖干預組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌屬（Bifidobac-terium）數(shù)量顯著增加（P＜0.01），別樣棒菌屬（Allobacul um）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）數(shù)量也有顯著上升（P＜0.05）。與肥胖對照組相比，有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預組大鼠腸道內(nèi)別樣棒菌屬（Allobaculum）、布勞特氏菌屬（Blautia）、羅斯拜瑞氏菌屬（Roseburia）數(shù)量顯著增加（P＜0.01）。

圖1 不同組別有差異菌科的相對豐度變化比較

圖2 不同組別有差異菌屬的相對豐度變化比較

2.3 各組別動物菌種分類水平上的腸道菌群豐度分布改變結(jié)果

如圖3所示，與對照組相比，肥胖對照組大鼠腸道內(nèi)布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）顯著增加（P＜0.05）。

干預后，與肥胖對照組相比，有氧運動組大鼠腸道內(nèi)嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）、糞便普雷沃氏菌（Prevetella copri）數(shù)量顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）；布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量減少，無顯著性差異。與肥胖對照組相比，復合多糖干預組大鼠腸道內(nèi)布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。與肥胖對照組相比，有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預組大鼠腸道內(nèi)布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量減少，無顯著性差異。

3 討論

3.1 高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道菌群組成的變化

圖3 不同組別有差異菌種的相對豐度變化分析結(jié)果

肥胖個體體內(nèi)存在腸道菌群數(shù)量比例及結(jié)構(gòu)失調(diào)的現(xiàn)象[22，23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，高脂膳食可誘導大鼠腸道內(nèi)菌群組成與比例發(fā)生深刻改變。在菌科水平，高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道內(nèi)瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）比例顯著增加；在菌屬水平，高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）與蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）比例顯著降低，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）可通過增強定植抗力，調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答以預防感染性疾病。李蘭娟研究證實雙歧桿菌與腸球菌的比值（Bifidobacterium/Enterococcus Ratio，B/E）可簡明的反映腸道菌群健康程度[24]。蘇黎世桿菌（Turicibacter）是Bosshard等2002年在蘇黎世分離得到的新型桿菌[25，26]，其生物學功能目前尚不清楚，推測可能與調(diào)節(jié)機體脂代謝有關(guān)。在菌種水平，高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道內(nèi)布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量顯著增加。瘤胃球菌（Ruminococcaceae）是已知與肥胖直接相關(guān)的菌群，肥胖個體腸道內(nèi)其比例會顯著上升[27-29]。

3.2 有氧運動對高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道菌群組成的影響

Matsumoto等通過比較自主轉(zhuǎn)輪運動大鼠體內(nèi)腸道菌群的變化發(fā)現(xiàn)：對照組和運動組大鼠的腸道菌群組成顯著不同，且運動組大鼠腸道內(nèi)腸道菌群的代謝產(chǎn)物丁酸鹽的濃度顯著升高[30]，提示運動引發(fā)了大鼠盲腸微生態(tài)環(huán)境的顯著變化。Choi等研究表明，運動可以有效減輕服用多氯化聯(lián)苯所引起的腸道菌群變化[31]。Evans等的研究表明，運動可改變實驗鼠體內(nèi)的腸道菌群，其體內(nèi)擬桿菌門/硬壁菌門的比值與運動量呈負相關(guān)[32]。

本研究中，與肥胖對照組相比，在菌科水平，6周有氧運動可使高脂膳食誘導肥胖組大鼠腸道中雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）顯著增加。雙歧桿菌（Bifidobacterium）是功能已確認的益生菌[32]，可促進短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SFCA）的生成，可增強腸道粘膜上皮細胞的免疫屏障功能。與之相對應(yīng)的是與肥胖呈正相關(guān)的瘤胃球菌（Ruminococcaceae）比例顯著降低，由此提示6周有氧運動可以優(yōu)化調(diào)節(jié)肥胖大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及數(shù)量比例。

在菌屬水平，有氧運動可使高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道中阿克曼菌屬（Akkermansia）、別樣棒菌屬（Allobaculum）、布勞特氏菌屬（Blautia）、普雷沃氏菌屬（Prevetella）數(shù)量增多。別樣棒菌屬（Allobaculum）、布勞特氏菌屬（Blautia）可產(chǎn)生SCFA，而在補充高膳食纖維食物后，腸道中普雷沃氏菌（Prevetella）數(shù)量增加[33]。以上結(jié)果提示有氧運動有助于提升動物腸道菌群健康程度。

在菌種水平，有氧運動可使高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）數(shù)量顯著增加。嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）是Derrien于2004年發(fā)現(xiàn)的可降解結(jié)腸內(nèi)表面黏液凝膠層中粘蛋白的革蘭氏陰性厭氧菌，在超過90%的成年個體腸道內(nèi)均有定植[34，35]。Maria對49名超重或肥胖個體的比較發(fā)現(xiàn)：腸道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）含量較高的個體代謝狀況更趨向于正常[36]。Clake等則發(fā)現(xiàn)優(yōu)秀橄欖球運動員腸道內(nèi)嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）所占比例較高[10]。Liou等發(fā)現(xiàn)進行胃旁路手術(shù)（gastric bypass）后的小鼠，其腸道內(nèi)阿克曼氏菌（Akkermansia）的相對豐度快速持續(xù)增加[37]。Lukovac等發(fā)現(xiàn)嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）可影響細胞脂代謝當中不同轉(zhuǎn)錄因子及基因的表達，包括禁食誘導脂肪因子（fasting induced adipose factor，F(xiàn)iaf）、SFCA的受體Gpr43及過氧化物增殖激活因子受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）等[38]。Reunanen等觀察到嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）可有效增強細胞屏障的整體結(jié)構(gòu)一體性，可使與之共培養(yǎng)的腸上皮細胞IL-8顯著增高100倍，提示其具有明顯的抗炎作用[39]。

同時，6周有氧運動使能夠有效調(diào)節(jié)糖代謝的糞便普雷沃氏菌（Prevetella copori）數(shù)量顯著增加，提示其可能通過影響菌群而改善宿主機體代謝[33]。與之相對應(yīng)的是，6周有氧運動使高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道中布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量降低。

上述菌群結(jié)構(gòu)組成的改變與我們之前所觀察到的有氧運動對肥胖大鼠身體成分、血脂成分、血清炎性因子的作用趨勢一致[12]，提示有氧運動調(diào)節(jié)優(yōu)化大鼠腸道菌群與上述表型的改善之間存在密切內(nèi)在聯(lián)系。

3.3 復合多糖干預對高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道菌群組成的影響

復合多糖可以刺激腸道內(nèi)有益菌的增殖、抑制有害菌的增殖，進而通過調(diào)整腸道內(nèi)失衡的菌群達到控制體重的目的。de Silva等研究發(fā)現(xiàn)通過復合多糖干預后，實驗動物腸道內(nèi)雙歧桿菌（Bifidobacterium）增加，同時體重下降[11]。Everard等通過給肥胖鼠喂食復合多糖，觀察到腸道內(nèi)硬壁菌門（Firmicutes）水平降低、擬桿菌門（Bacteroidetes）水平升高[40]。Parnell等研究發(fā)現(xiàn)，隨著復合多糖攝入的增多，肥胖動物體內(nèi)失衡的菌群結(jié)構(gòu)逐漸得到恢復[41]。提示復合多糖通過調(diào)理失衡的腸道菌群，可降低體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，有效抑制肥胖的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，與肥胖對照組相比，在菌科水平，6周復合多糖干預組雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）數(shù)量顯著增加，蘇黎世桿菌科（Turicibacter）數(shù)量顯著上升。Fukuda等利用多組學技術(shù)分析了雙歧桿菌（Bifidobacterium）對腸出血性大腸埃希氏菌株大腸桿菌O157:H7（enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7）所誘導的致死性感染小鼠模型的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp.Longum，JCM 1217T）可有效抑制上述致病菌的作用[42]。同時6周復合多糖干預可促使與肥胖呈正相關(guān)的瘤胃球菌（Ruminococcaceae）比例顯著降低，而與之同時產(chǎn)生內(nèi)毒素的脫硫弧菌科（Desulforibrionaceae）也顯著降低，與Cani等人的研究結(jié)果一致[43]。提示復合多糖干預對腸道菌群的優(yōu)化改善作用方式與有氧運動的調(diào)節(jié)作用方式可能不同。

在菌屬水平，6周復合多糖干預同樣可促使雙歧桿菌屬（Bifidobacteriium）數(shù)量顯著增加。在菌種水平，6周復合多糖干預可使布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量顯著減少。

上述復合多糖干預對高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道菌群主要組成的影響與我們之前所觀察到的復合多糖干預對肥胖大鼠身體成分、血脂成分、血清炎性因子的作用趨勢基本一致[12]，提示上述表型的改變與復合多糖調(diào)節(jié)的大鼠腸道菌群優(yōu)化改善之間存在密切內(nèi)在聯(lián)系。

3.4 有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預對高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道菌群組成的影響

與肥胖對照組相比，有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預組并未能取得實驗設(shè)計中預想的可能疊加或優(yōu)化作用，推測有氧運動與復合多糖灌胃干預二者對動物腸道菌群的影響趨勢似乎并不一致。這與之前觀察到的其對肥胖大鼠身體成分、血脂成分、血清炎性因子調(diào)節(jié)作用最差的結(jié)果一致[12]。

在菌科水平，6周有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預同樣可使雙歧桿菌科（Bifidobacterium）數(shù)量增加，提示其仍具備一定的對腸道菌群結(jié)構(gòu)的正向促進調(diào)節(jié)作用[22]；在菌種水平，6周有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預可使布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量減少。

4 小結(jié)

與對照組相比，高脂膳食誘導肥胖大鼠腸道中促進肥胖的布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量顯著增加，提示菌群組成改變可能是誘發(fā)肥胖的原因之一。

與肥胖對照組相比，有氧運動干預使大鼠腸道中可有效調(diào)節(jié)宿主代謝的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）、可調(diào)節(jié)宿主糖代謝的糞便普雷沃氏菌（Prevetella copri）數(shù)量顯著增加。提示有氧運動干預可通過上調(diào)有利于機體代謝的腸道菌群組成以改善上述代謝表型。與肥胖對照組相比，復合多糖干預使大鼠腸道內(nèi)可產(chǎn)生短鏈脂肪酸鹽，有良好腸道保護作用的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、別樣棒菌屬（Allobaculum）數(shù)量顯著增加；而可導致肥胖的布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）數(shù)量顯著減少。與肥胖對照組相比，有氧運動及復合多糖聯(lián)合干預使大鼠腸道中可產(chǎn)生SCFA的別樣棒菌屬（Allobaculum）、布勞特氏菌屬（Blautia）數(shù)量顯著增加。

以上結(jié)果提示不同干預方式均可使大鼠腸道菌群組成發(fā)生相應(yīng)改變，而上述腸道菌群的改變可能是影響血清相關(guān)指標及大鼠身體表型發(fā)生改變的原因。