段江南　蘇宏　王發(fā)艷　楊希

摘 要：利用青海湖裸鯉養(yǎng)殖廢水對(duì)小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，以及在開放條件下對(duì)小球藻生長趨勢進(jìn)行研究，同時(shí)篩選土著淡水輪蟲品種，為生物餌料的研究提供基礎(chǔ)支撐。本研究以BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在實(shí)驗(yàn)室和室內(nèi)開放條件下添加不同比例的養(yǎng)殖廢水，觀察小球藻的生長情況及水化學(xué)指標(biāo)，將通過篩絹過濾得到的土著淡水輪蟲接種于小球藻內(nèi)培養(yǎng)，定期用顯微鏡觀察輪蟲個(gè)體生長情況和數(shù)量等參數(shù)。結(jié)果表明：小球藻能夠較好地利用培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮，添加魚塘水的培養(yǎng)基培養(yǎng)的小球藻前期長勢更好；室內(nèi)開放條件下，小球藻的生長周期及生物量都明顯縮短；分離篩選得到的龜甲輪蟲和臂尾輪蟲能夠正常掛卵，但長期生長狀態(tài)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

關(guān)鍵詞：青藏高原；小球藻；輪蟲；葉綠素a；氨態(tài)氮

1引言

小球藻（Chlorella）為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，具有豐富的多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、葉綠素和一些生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值豐富，可作為天然水產(chǎn)餌料，改善水體化學(xué)環(huán)境條件，起到調(diào)節(jié)水質(zhì)的作用，在水產(chǎn)飼料行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景，普遍見于淡水漁業(yè)生產(chǎn)[1]。尤其作為培養(yǎng)輪蟲的首選餌料，是淡水輪蟲大規(guī)模生產(chǎn)的重要因素之一[2]。使用小球藻培養(yǎng)輪蟲，可優(yōu)化水質(zhì)并且提高培養(yǎng)總量，也可以作為一種優(yōu)質(zhì)餌料用于輪蟲的大規(guī)模培養(yǎng)[3]。與天然水產(chǎn)餌料相比，輪蟲的蛋白質(zhì)和粗脂肪含量均優(yōu)于其它，在適口性、易得性、飼養(yǎng)效果方面都屬上等餌料[4-7]。另外，輪蟲具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖快、容易培養(yǎng)等特點(diǎn)，因而在水產(chǎn)行業(yè)多有應(yīng)用 [8-10]。

在青藏高原水生動(dòng)物養(yǎng)殖及物種與環(huán)境保護(hù)方面小球藻并未得到廣泛應(yīng)用。高原特色物種青海湖裸鯉目前仍主要以雞蛋黃作為開口餌料，這種方法會(huì)導(dǎo)致成本偏高，在水體中投放量過多會(huì)造成水體污染，從而影響幼苗生長。為解決裸鯉開口餌料問題，本項(xiàng)目將小球藻作為輪蟲繁殖的主要營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)以后期大規(guī)模培養(yǎng)為目的，利用魚塘養(yǎng)殖廢水與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同配比為實(shí)驗(yàn)手段，探討適合小球藻大量快速生長的基本條件，為后期工廠化擴(kuò)培小球藻提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

2材料與方法

2.1材料

實(shí)驗(yàn)用小球藻購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，篩選土著淡水輪蟲品種的水樣取自青海湖裸鯉救護(hù)中心原種場西二魚塘底層，養(yǎng)殖廢水取自青海湖裸鯉救護(hù)中心原種場西二魚塘。

2.2方法

2.2.1不同配比培養(yǎng)基中小球藻生物量的測定方法

通過葉綠素a的含量間接反映小球藻的生物量，測定培養(yǎng)基葉綠素a的含量，用移液槍吸取4 mL小球藻液置于10 mL離心管中，于12000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入4 mL 80%丙酮重懸，4℃冰箱中放置過夜。將過夜重懸的藻液于12000 rpm離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至比色皿中，以80%丙酮作為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測定OD663、OD645值，根據(jù)下式計(jì)算葉綠素a含量，Ca（mg/L）=12.7OD663-2.69OD645。

2.2.2培養(yǎng)基中氨態(tài)氮的測定

向7支比色管中分別加入硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00，0.10，0.20，0.40， 0.60，0.80，1.00 mL，加水稀釋至總體積10 mL，加A試劑、B試劑各1.25 mL（A試劑：5 g苯酚和25 mg二水合亞硝基鐵氰化鉀溶解、定容至100 mL；B試劑：2 mL次氯酸鈉溶液（NaClO）和2.5 g NaOH溶解、定容至100 mL）。于水浴鍋中50℃水浴20 min，冷卻，測定OD625，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。水樣中氨態(tài)氮含量的測定：取水樣15 mL進(jìn)行抽濾，得到過濾水樣，取10 mL過濾水樣放入比色管中，加入A試劑、B試劑各1.25 mL，于水浴鍋中50℃水浴20 min，冷卻，測定OD625，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出氨態(tài)氮的含量。

2.2.3水樣初步處理及輪蟲篩選分離

將采集到的水樣攪拌均勻，使得水樣內(nèi)物體漂浮。取得的水樣用80目篩絹進(jìn)行過濾，用少量暴曬兩天的自來水將過濾在篩絹上的物體反復(fù)仔細(xì)沖洗1-2次，收集沖洗得到的水樣，用200目篩絹將水樣再次反復(fù)在同一200目篩絹上過濾，小心收集篩絹上所過濾得到的物體，用200 mL經(jīng)暴曬的自來水充分沖洗至250 mL燒杯中。用膠頭滴管吸取1-2 mL燒杯中的水樣滴加到浮游生物計(jì)數(shù)框內(nèi)置于光學(xué)顯微鏡下，先用4倍物鏡找到清晰視野觀察尋找輪蟲；找到后將物鏡擴(kuò)大至10倍調(diào)焦至清晰，接著再將物鏡轉(zhuǎn)換為40倍調(diào)焦至清晰并用拍照留圖，之后利用吸嘴前端剪去2-3 mm的2.5 μL移液槍槍頭在顯微鏡下分離輪蟲。

3結(jié)果與分析

3.1不同配比魚塘水小球藻生物量及氨態(tài)氮含量分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BG11/魚塘水為1：1和1：2的培養(yǎng)基，在1-9天內(nèi)生物量明顯高于BG11培養(yǎng)基（P<0.05），在第9天達(dá)到峰值，葉綠素a含量分別為0.617 mg/L和0.710 mg/L，從第9天起進(jìn)入衰亡期；BG11培養(yǎng)基葉綠素a含量在第24天達(dá)最大值1.097 mg/L，與初始葉綠素a含量相比增加0.991 mg/L，日平均生長量為0.041 mg/L，從第24天起進(jìn)入衰亡期。以葉綠素a為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制小球藻在不同培養(yǎng)基條件下的生長曲線，生長曲線見圖1。

小球藻對(duì)氨態(tài)氮的利用效果較好，三種培養(yǎng)基中氨態(tài)氮的初始濃度：1：2>1：1>BG11，且1：2培養(yǎng)基在第6天左右氨態(tài)氮含量達(dá)到最低值0.013 mg/L，1：1培養(yǎng)基在第9天左右氨態(tài)氮含量達(dá)到最低值0.034 mg/L，BG11培養(yǎng)基在第9天左右氨態(tài)氮含量達(dá)到最低值0.044 mg/L。從第10天起，可能存在硝態(tài)氮與氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮含量均有所回升。培養(yǎng)基中氨態(tài)氮含量變化情況如圖2。

3.2室內(nèi)開放培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)室條件下小球藻生長情況的分析

室內(nèi)開放培養(yǎng)中葉綠素a的初始含量為0.104mg/L，隨時(shí)間的變化為0～15 d上升，15 d后急速下降；實(shí)驗(yàn)室條件下小球藻的葉綠素a初始含量為0.106 mg/L，隨時(shí)間變化經(jīng)歷對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期，培養(yǎng)周期明顯長于室內(nèi)開放培養(yǎng)。

3.3顯微鏡下輪蟲的篩選分離

通過鏡檢可發(fā)現(xiàn)，青海湖裸鯉救護(hù)中心原種場西二魚塘水中生長有兩種不同的輪蟲，分別為臂尾輪蟲和龜甲輪蟲，鏡檢圖見圖3、圖4。分離過程中發(fā)現(xiàn)，臂尾輪蟲數(shù)量為1只/mL較龜甲輪蟲3只/mL少，但個(gè)體較大且活性及游動(dòng)能力很強(qiáng)，未見有其卵存在；龜甲輪蟲屬于優(yōu)勢種群，但個(gè)體較小且活性及游動(dòng)能力很弱，有掛卵成蟲和卵團(tuán)存在。

4討論

BG11/魚塘水為1：1與1：2小球藻的延滯期短，有可能是添加了魚塘水后有機(jī)質(zhì)豐富，小球藻快速渡過了這一時(shí)期，但BG11/魚塘水為1：1與1：2小球藻的最大生物量和對(duì)數(shù)生長期不如BG11，可能是由于微量元素的差異。實(shí)驗(yàn)表明小球藻對(duì)氨態(tài)氮的利用效果較好，BG11培養(yǎng)基在第9天左右氨態(tài)氮含量達(dá)到最低值0.044 mg/L。從第10天起，可能存在硝態(tài)氮與氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮含量有所回升，由此可以看出，小球藻對(duì)氨態(tài)氮的吸收不是簡單的正比關(guān)系。

葉綠素a含量變化結(jié)合溫度變化可知，在室內(nèi)開放條件下培養(yǎng)的小球藻與實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的小球藻相比，前者的生長時(shí)期縮短20天左右，沒有延緩期，衰亡迅速，葉綠素a含量差異顯著，可能因?yàn)樗诃h(huán)境溫度不穩(wěn)定，并且由于敞開培養(yǎng)導(dǎo)致外界生物進(jìn)入培養(yǎng)體系，對(duì)其生長產(chǎn)生影響。

由于輪蟲具有生命活性，在浮游生物計(jì)數(shù)框內(nèi)會(huì)保持游動(dòng)狀態(tài)，因此顯微鏡下分離輪蟲時(shí)一定要保證目標(biāo)輪蟲始終在視野范圍內(nèi)，用處理過的2.5 μL微量移液槍迅速吸出輪蟲后完成轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時(shí)應(yīng)反復(fù)吹打移液槍，防止輪蟲粘在槍頭；用于培養(yǎng)輪蟲的小球藻濃度不易過高，保持在105個(gè)/mL即可，濃度過高會(huì)影響輪蟲生長，其原因一方面是小球藻過度生長繁殖造成培養(yǎng)瓶內(nèi)養(yǎng)分與氧氣缺乏，影響輪蟲正常生長活動(dòng)，另一方面是小球藻濃度過高會(huì)使取樣鏡檢輪蟲的難度增加，不利于觀察；通過鏡檢發(fā)現(xiàn)小球藻有可能被其他藻類污染出現(xiàn)大面積死亡，從而導(dǎo)致輪蟲生存環(huán)境受脅，說明實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)液易被污染，以后再做此類實(shí)驗(yàn)時(shí)盡可能保持無菌環(huán)境，生長培育實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步進(jìn)行。

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作者簡介：

段江南（1993—），男，學(xué)士，就讀院校：青海大學(xué)。

楊希（1983-），通訊作者，博士，講師，主要研究方向：水生生物學(xué)。

基金項(xiàng)目：青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2016-S-3）