王永祥，張本忠，吳 聰，李豪杰，何文華，高小玲

(1.蘭州大學公共衛(wèi)生學院，蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院轉化醫(yī)學研究所，蘭州 730000)

據(jù)WHO估計，全球約有1/3的人口是結核分枝桿菌潛伏感染患者，其中有5%～10%的人會發(fā)展成活動性肺結核[1-2]。潛伏期結核分枝桿菌存在于肉芽腫組織中，這是一種低氧、高一氧化氮、營養(yǎng)物質匱乏的微環(huán)境[3]。結核分枝桿菌在此環(huán)境中處于休眠期，生長速度非常緩慢，也正是因為如此，結核分枝桿菌逃避了機體免疫系統(tǒng)的作用，從而存活下來[4-5]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌基因組存在著一組包含48個基因的休眠存活調節(jié)子(DosR),這48個基因編碼的蛋白控制著結核潛伏期的生理過程[6]。肉芽腫組織中的結核分枝桿菌存在著依賴氧壓的細胞和生化動力學機制，能夠使其快速適應微環(huán)境改變的能力，在此過程中結核分枝桿菌DsoR基因起著至關重要的作用[7-8]。與活動期結核分枝桿菌相比，DosR區(qū)域編碼的抗原能夠引起潛伏期結核患者產(chǎn)生更強烈的免疫反應[9]，這表明DosR基因很可能在潛伏期特異性表達。有研究報道，DosR基因編碼的許多蛋白有助于結核分枝桿菌利用其他碳源途徑獲得能量，如乙醛酸代謝、硝基還原和脂肪酸代謝等[10-11]。探索DosR基因生物學功能有助于進一步認識結核分枝桿菌潛伏期的生理調控過程，從而有針對性地進行檢測，實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的，對于預防活動性結核的發(fā)生至關重要。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 本實驗試劑結核分枝桿菌H37Rv株，載體pET30a由本實驗室保存。大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊公司；質粒提取試劑盒購自北京天恩澤公司；膠回收試劑盒購自Zymo公司；各種限制性內切酶購自Thermo公司；DNA聚合酶和連接酶購自TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自Sigma公司。美國Biorad酶標儀。

1.2方法

1.2.1結核分枝桿菌DNA的提取 結核分枝桿菌DNA的提取依據(jù)已報道的文獻進行[12]。具體方法如下： 挑取結核分枝桿菌菌落，置于裝有200 μL生理鹽水的1.5 mL離心管中，80 ℃煮沸滅活30 min，12 000 r/min離心15 min后，加入蛋白酶K和溶菌酶充分裂解結核分枝桿菌，然后用酚-氯仿抽提法獲取結核分枝桿菌基因組，無水乙醇沉淀雙鏈DNA，干燥后TE緩沖液(50 μL)溶解DNA。

1.2.2引物設計 在DBGET數(shù)據(jù)庫中查找結核基因Rv2029c的全基因序列，然后采用Primer5.0和Oligo6.0設計Rv2029c特異性引物序列，上下游分別插入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。設計的引物序列為上游引物Rv2029F：CGG AAT CCA TGA CGG AGC CAG CGG CGT，其中CG是保護性堿基，GAA TCC是EcoRⅠ酶切位點；下游引物Rv2029R：CCC AAG CTT TCA TGG CGA GGC TTC CGG GTT，其中CCC是保護性堿基，AAGCTT是HindⅢ酶切位點。

1.2.3純化目的基因 采用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法對目的基因進行擴增，擴增條件：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸80 s，共擴增35個循環(huán)。擴增后的目的基因利用膠回收試劑盒(美國Zymo公司膠回收試劑盒，D4007)進行純化和濃縮。具體方法如下：首先在瓊脂糖凝膠上準確切取目的基因片段，然后加入凝膠溶解液，37～55 ℃孵育融化5～10 min后，過柱離心吸附，加Washing buffer洗滌2次后，用10～20 μLTE緩沖液洗脫即可。

1.2.4重組質粒的構建 重組質粒PE730a-Rv2029c的構建依據(jù)文獻[12]，主要概述如下：用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ對目的基因和載體pET30a進行雙酶切，然后經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。目的基因和載體按3∶1的比例，在DNA連接酶的作用下，16 ℃過夜連接。連接后的目的基因，導入到大腸埃希菌感受態(tài)(BL21)細胞中，4 ℃水浴30 min后，42 ℃準確熱激45 s后，加入無抗菌藥物的LB培養(yǎng)液后，細菌復蘇45 min，然后將細菌均勻涂到含卡那霉素(50 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿中，37 ℃過夜后挑取陽性單克隆菌落并提取質粒(北京天恩澤公司質粒提取試劑盒，60205)，雙酶切(EcoRⅠ和HindⅢ)鑒定后送南京金斯瑞公司進行測序分析。

1.2.5重組質粒pET30a-Rv2029c促生長作用研究 大腸埃希菌BL21是一種常用的基因工程表達菌株，其生長分為遲緩期、對數(shù)期、平臺期和衰亡期。遲緩期大腸埃希菌適應新的環(huán)境，因此生長速度很慢，對數(shù)期營養(yǎng)物質充分，細菌呈對數(shù)增長，隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的不斷消耗，大腸埃希菌代謝產(chǎn)物不斷積累，培養(yǎng)基pH逐漸下降，大腸埃希菌生長速度變慢，細菌總數(shù)趨于穩(wěn)定。大腸埃希菌的平臺期與結核分枝桿菌的肉芽腫微環(huán)境相似，對細菌的生長都是一種不利的環(huán)境，以此模擬肉芽腫微環(huán)境，將結核DosR蛋白導入大腸埃希菌BL21中，觀察對其生長有無影響。

取出保存的pET30a大腸埃希菌(空質粒組)和pET30a-Rv2029c大腸埃希菌(重組質粒組)，在含50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，記錄吸光度(OD)600值。然后將菌液調整至相同的OD值并吸取600 μL菌液加至300 mL LB培養(yǎng)基中(含 50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃ 300 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取600 μL菌液，檢測OD值(每次測3組OD值，每組測200 μL)。在第5個小時當2組大腸埃希菌OD值為0.45時，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(500 mmol/L),之后繼續(xù)每隔1 h取600 μL菌液測OD值，如此連續(xù)重復測量15 h。在相同條件(相同菌種，相同生長和測量條件)下重復該實驗3次。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0對1.6實驗結果進行定量數(shù)據(jù)重復測量的方差分析及t檢驗，比較空質粒組與重組質粒組對大腸埃希菌OD值是否產(chǎn)生影響，并作出生長曲線圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1Rv2029c基因擴增結果 以提取的結核基因組為模板，在設計好的引物作用下，行PCR擴增。PCR成功擴出Rv2029c DNA，大小1 020 bp。見圖1。

注：1為基因Rv2029c；M為DNA2000標記物

圖1結核DosR基因Rv2029c PCR結果

2.2pET30a-Rv2029c重組質粒的構建與鑒定 將挑取的單克隆菌用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，陽性重組質粒能切出2條基因片段，分別為質粒pET30a(5 422 bp)和插入的目的基因Rv2029c(1 020 bp)。與連接片段大小吻合，可初步認為pET30a-Rv2029c構建成功。見圖2。

注：M為DNA標記物；1～2為陰性質粒；3為陽性質粒pET30a-Rv2029c

圖2 pET30a-Rv2029c重組質粒酶切鑒定結果

2.3基因測序結果和GenBank序列比對 將酶切鑒定成功的重組質粒送往南京金斯瑞公司進行測序，測序結果與GenBank所給序列進行Blast?；騌v2029c與GenBank中所給序列完全吻合，重復率100%，基因無突變。

2.4pET30a-Rv2029c促大腸埃希菌生長的統(tǒng)計學分析 將3次測量獲得的資料進行重復測量的方差分析，結果顯示sum值觀察時間效應：不同時間OD值差異有統(tǒng)計學意義(F=8 351.248，P<0.05)，空質粒組(pET30a)和重組質粒組(pET30a-Rv2029c)不同時間OD值差異均有統(tǒng)計學意義(F=3 593.681、4 125.791，P<0.05)。sum值觀察處理因素效應,重組質粒組(pET30a-Rv2029c)OD值高于空質粒組(pET30a)(t=4 416.54，P<0.05)。從各時間點來看，0～5 h空質粒組和重組質粒組(pET30a-Rv2029c)OD值差異無統(tǒng)計學意義(t=1.372、1.220、0.894、0.935、0.787、0.395，P>0.05)，6～15 h由于加入IPTG誘導了蛋白Rv2029c的表達，OD值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；生長時間和處理因素存在交互效應(F=767.049，P<0.05)。見表1。

表1 0～15 h導入Rv2029c對大腸埃希菌OD值的影響

組別生長時間(h)101112131415sumFP空質粒組x0.605 0.608 0.616 0.610 0.608 0.618 0.411 3 593.6810.000 s0.018 0.007 0.010 0.011 0.014 0.011 0.272 重組質粒組x1.015 1.057 1.097 1.103 1.164 1.159 0.658 4 125.7910.000 s0.023 0.017 0.027 0.026 0.056 0.022 0.476 sumx0.809 0.832 0.856 0.856 0.885 0.889 0.534 *8 351.248* 0.000*s0.212 0.231 0.248 0.254 0.289 0.279 0.371 *t42.664 70.736 49.077 51.358 28.815 66.182 4 416.540* P0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 *

2.5pET30a-Rv2029c促大腸埃希菌生長曲線 以生長時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制出大腸埃希菌生長曲線見圖3。在5 h時(此時OD值約為0.45)加入IPTG，空質粒組(pET30a)大腸埃希菌在6 h進入平臺期，而重組質粒組(pET30a-Rv2029c)卻能繼續(xù)維持對數(shù)期達10 h左右，并且突破大腸埃希菌的生長界限，使大腸埃希菌的OD值達到1.16左右才進入平臺期，若以OD值反映大腸埃希菌數(shù)量，則重組質粒(pET30a-Rv2029c)能促使大腸埃希菌生長量提高1倍。

圖3 蛋白Rv2029c促大腸埃希菌生長曲線

3 討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)導入了重組質粒pET30a-Rv2029c的大腸埃希菌與不導入該基因的大腸埃希菌相比，存在著某種機制使大腸埃希菌能夠在低氧、營養(yǎng)物質匱乏的環(huán)境下繼續(xù)維持在對數(shù)生長期，增強了大腸埃希菌抵抗應激環(huán)境的能力，增加了大腸埃希菌的數(shù)量。Rv2029c蛋白在Mg2+和ATP的參與下催化6磷酸果糖形成2,6二磷酸果糖，因此在糖代謝中起著重要作用。含有重組質粒pET30a-Rv2029c的大腸埃希菌可能通過Rv2029c蛋白，調節(jié)營養(yǎng)物質的供給，提高了對抗低氧環(huán)境，增加了利用糖酵解的能力，與不含Rv2029c的大腸埃希菌相比突破了糖代謝和糖利用的上限，促進了大腸埃希菌的生長。

結核分枝桿菌的肉芽腫環(huán)境同大腸埃希菌平臺期環(huán)境相似，都存在營養(yǎng)物質匱乏、低氧、代謝產(chǎn)物增加等對細菌生存不利的因素，依此推斷，結核分枝桿菌蛋白Rv2029c可能在肉芽腫環(huán)境組織中起到重要的維持細菌存活的作用。結核分枝桿菌在潛伏期為適應肉芽腫的微環(huán)境，一方面需要減少自身代謝活動從而進入休眠期，KUMAR等[13]對DosR蛋白中的Rv0079(休眠相關翻譯抑制子DATIN) 的研究證實了這一點，發(fā)現(xiàn)此蛋白抑制了大腸埃希菌的生長，這是因為該蛋白與核糖體30S亞基結合從而阻斷了蛋白合成中的翻譯過程，降低了細菌的繁殖速度，使其進入休眠期。另一方面結核分枝桿菌可能需要最大限度利用環(huán)境中營養(yǎng)物質、氧氣等滿足自身生存基本需要，本文研究的結果支持了這一點，生物信息學分析表明蛋白Rv2029c為6-磷酸果糖激酶2，此蛋白屬于pfkB糖激酶超家族，是糖代謝的一種重要信號酶，通過影響2，6二磷酸果糖的水平實現(xiàn)對糖酵解通路的調節(jié)，增強了結核分枝桿菌在肉芽腫環(huán)境中最大程度利用氧氣和營養(yǎng)物質的能力，維持結核分枝桿菌生存基本需求。進一步研究該蛋白促進細菌糖酵解的具體機制是下一步研究的方向。