石 彬，李詠富*，吳遠根

（1.貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

土霉素（oxytetracycline，OTC）又稱5-羥基四環(huán)素、地霉素、地靈霉素、氧四環(huán)素等[1]，作為一種重要的四環(huán)素類抗生素，土霉素具有廣譜抗生活性[2]，對畜禽類疾病的防治和治療具有很好的效果，在養(yǎng)殖行業(yè)使用廣泛[3]。但由于利益的驅(qū)使，近年來土霉素在養(yǎng)殖行業(yè)存在濫用的現(xiàn)象。目前已經(jīng)有人在水體中檢出了土霉素等類四環(huán)類抗生素，現(xiàn)有技術(shù)無法對其進行有效的處理[4-5]。在我國，每年有數(shù)千噸土霉素被用于獸藥的生產(chǎn)中。過量的土霉素會殘留在動源性食品中，隨食物鏈進入人體，損害人體的皮膚、免疫系統(tǒng)以及造成肝腎損傷等[6]，并可能會誘導(dǎo)具有超強抗藥性的病菌產(chǎn)生，威脅公共衛(wèi)生安全，對人類健康造成巨大的威脅[7-10]。為了有效地監(jiān)管土霉素的殘留，許多國家對動源性食品中土霉素的含量都做出了嚴(yán)格規(guī)定[11-12]。傳統(tǒng)的土霉素檢測方法主要有微生物檢測法、色譜檢測法以及免疫學(xué)方法等。這些方法雖然基本上能夠滿足檢測的要求，但是存在著耗時、設(shè)備昂貴、需要標(biāo)準(zhǔn)品、特異性差、樣品前處理繁瑣等不同的缺點[13]，因此建立一種快速、簡便的新檢測方法顯得十分重要[14]。

氯化血紅素（hemin）是一種由原卟啉IX與鐵（II）絡(luò)合形成的化合物，具有辣根過氧化物酶活性。在以3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）和雙氧水（H2O2）作為底物時，可以通過改變氯化血紅素催化活性，使底物因為失電子情況不同而產(chǎn)生不同顏色的產(chǎn)物。有文獻報道[15]利用氯化血紅素催化活性成功建立了一種水體三價砷的比色檢測方法，分別得到0.6 μg/L和0.77 μg/L兩組最低檢測限度。本研究將氯化血紅素的催化特性運用于土霉素的檢測，以期建立一種基于氯化血紅素檢測的土霉素的方法，為快速、簡便檢測乳制品中土霉素提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氯化血紅素（hemin）：上海生工生物有限公司；雙氧水、TMB（分析純）：Sigma-Aldrich公司；硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate，STR）、雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，DIC）、阿莫西林（amoxicillin，AMX）、卡馬西平（carbamazepine，CBZ）、硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate，KAN）、青霉素鉀（ben zylpenicillin potassium，PEN）（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛奶樣品：內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TUS-200P振蕩型恒溫金屬孵育器：上海一恒科技有限公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀：Thermo Fisher Scientific公司；BS124S分析天平：德國Sartorius公司；SP-701 pH計：上海志榮電子科技有限公司；CT14RD高速臺式冷凍離心機：上海天美科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf Research移液槍：德國Eppendorf公司；NJ75-101-3A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海久濱儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

氯化血紅素（hemin）是人工合成的一種水溶性血紅素的氯化物，在磷酸二氫鈉緩沖溶液中，氯化血紅素具有辣根過氧化物酶活性，在H2O2存在時可以催化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生不同顏色的產(chǎn)物。當(dāng)氯化血紅素過氧化物酶活性較強時，底物TMB失去2個電子，生成黃色產(chǎn)物在波長450nm處展現(xiàn)特征吸收峰。當(dāng)氯化血紅素的過氧化物酶活性較弱時，TMB失去1個電子，生成產(chǎn)物呈藍綠色，在波長450 nm處左右沒有特征吸收峰。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)催化反應(yīng)體系中存在土霉素（OTC）時，氯化血紅素的催化活性受到抑制，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物在波長450 nm處的吸光度值顯著降低，生成藍綠色產(chǎn)物。且OTC濃度與產(chǎn)物吸光度值下降的幅度（ΔA450nm）成正比，通過觀察顏色變化或測定ΔA450nm，實現(xiàn)對OTC的定性和定量檢測。實驗原理如圖1所示。

圖1 氯化血紅素催化檢測土霉素原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of hemin catalytic for oxytetracycline detection

1.3.2 OTC含量檢測條件優(yōu)化

在1.5 mL離心管中，加入5 μL的待測樣品，30℃恒溫孵育10 min，隨后向體系中加入5 μL不同濃度的氯化血紅素溶液（10 μmol/L、15 μmol/L、17.5 μmol/L、20 μmol/L、22.5 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L）充分混勻，30 ℃繼續(xù)孵育30 min。隨后向體系中加入不同pH值的磷酸二氫鈉溶液（pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0）定容至500 μL。充分混勻后，向體系中加入10 μL H2O2與10 μL TMB溶液，混勻，然后分別取200 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液置于96孔酶標(biāo)板中，測定波長450 nm處的吸光度值，獲得其吸收光譜。計算其在波長450 nm處與空白樣品吸光度值差值ΔA450nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算待測樣品中OTC含量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取18支1.5mL離心管，分別加入5μL不同濃度的OTC標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個檢測體系中的OTC含量維持在0～400nmol/L，30℃恒溫孵育10min，隨后向體系中加入5μL優(yōu)化后的氯化血紅素溶液充分混勻，30℃繼續(xù)孵育30min。隨后向體系中加入優(yōu)化后磷酸二氫鈉緩沖溶液至500μL。充分混勻后，向體系中加入10 μLH2O2與10 μLTMB溶液，混勻，然后分別取200μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液置于96孔酶標(biāo)板中，測定波長450nm處的吸光度值，獲得其吸收光譜。以不同濃度的土霉素測定的ΔA450nm（不同濃度樣品的吸光度值-空白樣品的吸光度值）作圖，做三組平行，取平均值，繪制OTC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 牛奶樣品預(yù)處理

取100mL牛奶樣品加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8，充分混勻后超聲5min，隨后加入2%的三氯乙酸以消除鈣離子的影響。混合物加入離心管中，8000r/min、4℃低溫離心15min。取上清液，過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 OTC含量檢測條件優(yōu)化

2.1.1 催化體系檢測可行性分析

對氯化血紅素檢測方法的可行性進行了研究。按照1.3.2的方法，選取5組不同催化條件，檢測其在3 min時，波長300～800 nm范圍內(nèi)的吸光度圖譜，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同催化條件對氯化血紅素催化反應(yīng)的影響Fig.2 Effects of different catalytic conditions on hemin catalytic reaction

由圖2可知，當(dāng)催化體系中不存在抗生素類物質(zhì)時，氯化血紅素的催化能力較強，反應(yīng)產(chǎn)物在波長450 nm處的吸光度值達到1.4，生成產(chǎn)物顏色呈黃色；當(dāng)體系中存在硫酸鏈霉素（STR）和雙氯芬酸鈉（DIC）時，A450nm顯有下降，下降的幅度不明顯，生成產(chǎn)物顏色偏黃色。當(dāng)體系中存在OTC時，A450nm顯著降低，生成產(chǎn)物偏藍綠色。且200 nmol/L OTC體系的A450nm下降幅度明顯大于100 nmol/L OTC體系，反應(yīng)產(chǎn)物顏色也更綠。結(jié)果表明OTC能夠有效降低氯化血紅素的催化活性，且氯化血紅素催化活性下降幅度與OTC濃度成正比，反應(yīng)具有較好的特異性。

2.1.2 氯化血紅素濃度的選擇

在催化檢測體系中，氯化血紅素濃度是重要決定因素。通過氯化血紅素濃度的優(yōu)化，能夠提高反應(yīng)檢測靈敏度，達到檢測差異最大化。按照1.3.2的方法，采用單因素法，固定其他條件不變，分別選擇氯化血紅素濃度為10 μmol/L、15 μmol/L、17.5 μmol/L、20 μmol/L、22.5 μmol/L、25 μmol/L、30μmol/L，檢測并計算各組樣品的吸光度值差值ΔA450nm。檢測時間間隔1min，檢測時間10min，最大吸光度值差值記為ΔA450nmmax，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同氯化血紅素濃度對催化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of different hemin concentration on catalytic reaction

由圖3可知，除了濃度30 μmol/L的氯化血紅素催化體系外，其他濃度的氯化血紅素體系反應(yīng)產(chǎn)物ΔA450nm均隨著時間的延長而先上升，達到峰值ΔA450nmmax后開始下降；當(dāng)氯化血紅素濃度＜20 μmol/L時，濃度尚未飽和；隨著氯化血紅素濃度的升高，ΔA450nmmax的值逐漸增大；當(dāng)氯化血紅素濃度＞20 μmol/L時，濃度達到飽和，由于電荷相互影響分子聚集等原因，隨氯化血紅素濃度升高，ΔA450nmmax的值逐漸減小。當(dāng)體系氯化血紅素濃度為20 μmol/L時，產(chǎn)物ΔA450nmmax的值達到最大，檢測差異最明顯；30μmol/L的氯化血紅素由于濃度過大，導(dǎo)致催化反應(yīng)產(chǎn)物ΔA450nm在1 min內(nèi)已經(jīng)達到峰值；因此最終選擇氯化血紅素濃度20μmol/L為最優(yōu)檢測濃度。

2.1.3 反應(yīng)體系pH選擇

pH變化對任何反應(yīng)體系都有很大的影響，直接影響反應(yīng)體系中分子的電離情況，pH過高或者過低，都不利于催化反應(yīng)的進行。按照1.3.2的方法，固定其他條件不變，選擇pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0的磷酸二氫鈉緩沖液，檢測并計算各組樣品的吸光度值差值ΔA450nm。檢測時間間隔1min，檢測時間10min，最大吸光值差值記為ΔA450nmmax，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同反應(yīng)體系pH值對催化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of different pH value on catalytic reaction

由圖4可知，隨著時間的增加，ΔA450nm的值先升高，達到峰值后開始下降。當(dāng)pH為3.0時，ΔA450nm在反應(yīng)8 min左右達到最大值為0.39；當(dāng)pH為3.5時，ΔA450nm在4 min時達到最大值為1.05；當(dāng)pH分別為4.0、4.5和5.0時，ΔA450nm分別在反應(yīng)3 min、3 min和2 min時達到最大值，分別為0.80、0.59和0.21。結(jié)果表明，在一定pH范圍內(nèi)，隨著體系磷酸二氫鈉緩沖液pH的升高，ΔA450nm達到峰值的時間逐漸縮短；pH值為3.5時，ΔA450nmmax達到峰值，催化產(chǎn)物檢測差異達到最大。pH值過高或過低時，催化體系中分子基團的電離情況發(fā)生變化，催化活性發(fā)生改變，檢測差異變小。故最終選擇pH 3.5為體系最優(yōu)pH值。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，選擇氯化血紅素濃度為20 μmol/L，磷酸二氫鈉緩沖液pH為3.5，在0～400nmol/L范圍內(nèi)選擇不同濃度的OTC標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.3的方法，對其在波長450nm處的吸光度值進行檢測。以O(shè)TC的濃度（C）為橫坐標(biāo)，ΔA450nm（Y）為縱坐標(biāo)，繪制OTC標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。

圖5 土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of oxytetracycline

由圖5可知，在OTC濃度在0～400nmol/L范圍內(nèi)，ΔA450nm與OTC濃度符合Logistic模型，具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.997。在低濃度25～90 nmol/L的范圍內(nèi)，ΔA450nm與OTC濃度呈良好的線性關(guān)系，擬合方程為Y=1.04×10-3C+0.0622。由公式計算出最低檢測限度為21.89 nmol/L，遠遠低于歐盟和美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）對牛奶中OTC的最大殘留限量。

2.3 檢測特異性研究

檢測特異性考查檢測方法的一個重要指標(biāo)。為證實氯化血紅素催化檢測體系對OTC具有特異性的識別能力，即檢測的特異性，考查了其他競爭性抗生素土霉素（OTC）、雙氯芬酸鈉（DIC）、硫酸鏈霉素（STR）、阿莫西林（AMX）、硫酸卡那霉素（KAN）、青霉素鉀（PEN）這6不同種類的抗生素對檢測體系的干擾情況。按照1.3.2的方法。分別向檢測體系中加入200 nmol/L和100 nmol/L的不同種類的抗生素，測定其與空白樣品在波長450 nm處的吸光度值差值ΔA450nm。以4 min時不同樣品的ΔA450nm值作柱狀圖，結(jié)果如圖6、圖7所示。

圖6 200 nmol/L不同種類抗生素對土霉素檢測的影響Fig.6 Effect of different antibiotics with concentration of 200 nmol/L on the detection of oxytetracycline

圖7 100 nmol/L不同種類抗生素對土霉素檢測的影響Fig.7 Effect of different antibiotics with concentration of 100 nmol/L on the detection of oxytetracycline

由圖6可知，當(dāng)OTC存在時，ΔA450nm的值最大，為1.26，顯著高于其他抗生素；從反應(yīng)顏色上判斷，當(dāng)體系加入200 nmol/L OTC時反應(yīng)產(chǎn)物呈藍色，而加入其他抗生素時則呈黃色。由圖7可知，加入100nmol/LOTC時，產(chǎn)物的ΔA450nm為1.02，低于OTC濃度為200 nmol/L的體系，明顯高于其他種類的抗生素。當(dāng)體系加入100 nmol/L OTC時反應(yīng)產(chǎn)物呈藍綠色，而加入100 nmol/L的其他抗生素則呈黃色。表明該體系對OTC檢測具有良好的選擇性。

2.4 實際樣品檢測

按照1.3.4的方法對牛奶樣品進行前處理，在空白牛奶樣品中添加不同濃度的OTC標(biāo)準(zhǔn)液（50 nmol/L、80 nmol/L、100nmol/L、200nmol/L）。在最優(yōu)條件下，測定4組不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)物波長450 nm處的吸光度值，每個濃度樣品重復(fù)測定3次，測定結(jié)果見表1。

表1 牛奶樣品中土霉素加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of adding standard recovery rate of oxytetracyclinein milk samples

由表1可知，其平均加標(biāo)回收率范圍為90.50%～107.55%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.39%～4.02%。實驗結(jié)果表明，根據(jù)實際檢測量所計算出的該方法的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在殘留實驗準(zhǔn)則允許的范圍之內(nèi)，具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度，符合抗生素殘留量分析和檢測標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求，可以實現(xiàn)對OTC殘留有效檢測。

3 結(jié)論

利用氯化血紅素的辣根過氧化物酶活性建立了一種新的OTC的快速檢測方法。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、重復(fù)性好的特點，可用于乳制品中OTC的快速比色檢測。

在氯化血紅素濃度為20 μmol/L，pH值為3.5條件下，反應(yīng)體系檢測差異性達到最大，檢測效果最好。最低檢測限度為21.89nmol/L，遠遠低于國際上牛奶中OTC的最大殘留限量規(guī)定。該方法對其他抗生素的抗干擾能力較強，同時具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可以對OTC殘留檢測進行有效檢測。