張 冰，張會娟，張全盛，布文昊，朱瑞艷，劉志偉，朱海洋，高大威*

（1.燕山大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.秦皇島櫻韻酒業(yè)有限公司，河北 秦皇島 066200）

酵素是指植物經(jīng)深層發(fā)酵，提取的一種含生物活性物質(zhì)的低鹽液體。其不僅含有植物本身的營養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵所得的酶及還原性物質(zhì)，還可影響服用者體內(nèi)的活性酶系，從細(xì)胞層面調(diào)節(jié)機(jī)體的生命活動[1]，從而具有抗癌、降血壓、整腸、消除便秘、抵御痛風(fēng)、減肥、抗過敏等的功效[2]。脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶[3]，是膳食脂肪消化的主要酶，其表達(dá)的改變與肥胖等代謝性疾病有著密切的關(guān)系，是治療肥胖等代謝性疾病的靶點(diǎn)[4]。還原性是指在化學(xué)反應(yīng)中原子、分子或離子失去電子的能力。還原性物質(zhì)與其他物質(zhì)在一起時，可以保護(hù)其他物質(zhì)免受氧化，具有抗氧化作用。還原性物質(zhì)對人的生長、代謝及免疫皆有益。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，櫻桃富含多種重要的天然保健功能成分，具有顯著的抗病保健功效，因此櫻桃保健價(jià)值的研究也日趨增多[5-6]。由于夏季氣溫高，櫻桃不易保存，冷藏容易導(dǎo)致果實(shí)破裂，而且存儲時間較短；冷凍處理后，雖能延長保存時間，但解凍后櫻桃質(zhì)地會有較大變化。因此本試驗(yàn)將櫻桃制成櫻桃酵素，并采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化櫻桃酵素的發(fā)酵條件，以期可以延伸櫻桃產(chǎn)業(yè)鏈，增加櫻桃產(chǎn)業(yè)的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山海關(guān)本地大櫻桃、白砂糖：市售；VL2酵母：天津盛豐商貿(mào)有限公司；復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=1∶1，酶活50 000 U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4恒溫水浴鍋、HN-25S恒溫培養(yǎng)箱：邦西儀器科技上海有限公司；721紫外可見光分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；JM-BL電子天平：余姚市紀(jì)銘稱重校檢設(shè)備有限公司；18L高壓蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；78-1磁力攪拌器：江蘇金壇科技儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 櫻桃酵素的制備

準(zhǔn)確稱取VL2酵母菌種0.1 g，加入0.05 g/mL的糖水10 mL，40℃水浴活化酵母30 min。過濾后的櫻桃果漿添加一定量的復(fù)合酶，50℃水浴3 h酶解。酶解后的櫻桃果漿添加一定量的白砂糖，接種一定量活化后的酵母，于培養(yǎng)箱中一定溫度條件下發(fā)酵一定時間。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

分別設(shè)定酵母接種量為5%、10%、15%、20%、25%；加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質(zhì)量比）為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1；復(fù)合酶添加量為200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g、600 U/g；發(fā)酵時間為2 d、3 d、4 d、5 d、6 d；發(fā)酵溫度為25℃、30℃、34℃、37 ℃；發(fā)酵初始pH為3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0。采用單一變量控制法進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵后對分組樣品脂肪酶活性和還原力水平進(jìn)行測定[8-10]。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵時間（A）、加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質(zhì)量比）（B）、復(fù)合酶添加量（C）、接種量（D）為正交試驗(yàn)的4個因素，每個因素設(shè)置3個水平，以脂肪酶酶活和還原力為考察指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 櫻桃酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cheery enzyme fermentation process optimization

1.3.4 測定方法

脂肪酶活力：按照參考文獻(xiàn)[11-12]的方法測定脂肪酶活力。酶活力單位定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol脂肪酸的酶量定義為1個脂肪酶酶活力單位（U）。脂肪酶酶活力的計(jì)算公式如下：

式中：X為脂肪酶酶活力，U/mL；c為脂肪酸濃度，μmol/mL；V為脂肪酸溶液的體積，mL；t為作用時間，min；V1為酶液用量，mL。

還原力：按照參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測定。將測定的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)維生素C（vitamin C，VC）溶液吸光度值對照，樣品的吸光度值越大，說明樣品還原力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時間對櫻桃酵素發(fā)酵的影響

由圖1可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨發(fā)酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢；發(fā)酵第5天時脂肪酶酶活達(dá)到最高，為902 U/mL。還原力在發(fā)酵2～3 d時迅速升高，3～5 d增速減緩，5 d后開始迅速下降，發(fā)酵第5天時酵素的還原力吸光度值為1.158，相當(dāng)于2.25 mg/mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液。綜合考慮脂肪酶酶活及還原力，選取發(fā)酵時間為4 d。

圖1 發(fā)酵時間對櫻桃酵素發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on cheery enzyme fermentation

2.1.2 加糖量對櫻桃酵素發(fā)酵的影響

圖2 加糖量對櫻桃酵素發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of sugar addition on cheery enzyme fermentation

由圖2可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨加糖量的減小呈先上升后下降的趨勢；加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質(zhì)量比）為5∶1時脂肪酶酶活達(dá)到最高，為930 U/mL。還原力在加糖量為2∶1～3∶1呈上升趨勢且3∶1時達(dá)到最高，之后逐漸降低，加糖量為3∶1時還原力吸光度值為1.003，相當(dāng)于1.95 mg/mLVC標(biāo)準(zhǔn)溶液。綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選取櫻桃果漿與白砂糖質(zhì)量比為4∶1。

2.1.3 復(fù)合酶添加量對櫻桃酵素發(fā)酵的影響

由圖3可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨復(fù)合酶的升高呈先上升后下降的趨勢；復(fù)合酶加酶量為500 U/g時脂肪酶酶活達(dá)到最高，為795 U/mL。還原力在復(fù)合酶添加量為200～300 U/g緩慢上升，300～400 U/g急速上升且400 U/g時含量最高，之后逐漸降低，復(fù)合酶添加量為400 U/g時還原力吸光度值為0.947，相當(dāng)于1.84 mg/mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液。綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選取復(fù)合酶添加量為400 U/g。

圖3 復(fù)合酶添加量對櫻桃酵素發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of compound enzyme addition on cheery enzyme fermentation

2.1.4 接種量對櫻桃酵素發(fā)酵的影響

圖4 接種量對櫻桃酵素發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of inoculum on cheery enzyme fermentation

由圖4可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨接種量的增加呈先上升后下降的趨勢；接種量為10%時脂肪酶酶活達(dá)到最高，為807U/mL。還原力在接種量為5%～10%呈上升趨勢，之后呈下降趨勢，接種量為10%時還原力吸光度值為0.963，相當(dāng)于1.87 mg/mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液。綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選取接種量為10%。

2.1.5 發(fā)酵溫度對櫻桃酵素發(fā)酵的影響

圖5 發(fā)酵溫度對櫻桃酵素發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on cheery enzyme fermentation

由圖5可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨發(fā)酵溫度的升高呈先上升后下降的趨勢；發(fā)酵溫度30℃時脂肪酶酶活達(dá)到最高，為1 031 U/mL。還原力在發(fā)酵溫度為25～30℃迅速上升且30℃時水平達(dá)到最高，之后還原力下降，發(fā)酵溫度為30℃時還原力吸光度值為1.010，相當(dāng)于1.96 mg/mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選擇發(fā)酵溫度為30℃。

2.1.6 初始pH值對櫻桃酵素發(fā)酵的影響

由圖6可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨發(fā)酵液初始pH值的升高呈先上升后下降的趨勢；初始pH值為4.8時脂肪酶酶活達(dá)到最高，為898 U/mL。還原力在發(fā)酵液初始pH值為3.8～4.4迅速上升，pH4.4～5.0下降，發(fā)酵液pH值為4.4時的還原力最高，吸光度值為0.966，相當(dāng)于1.88 mg/mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，故選擇初始pH為4.4。

2.2 正交試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)有脂肪酶酶活和還原力2個指標(biāo)，為了得到櫻桃酵素發(fā)酵最佳條件，采用多指標(biāo)試驗(yàn)簡易公式評分法。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析，綜合評分計(jì)算公式：

式中：yi表示第i次試驗(yàn)的綜合評分值，xij表示第j個指標(biāo)的第i次試驗(yàn)的測定值，Sj為樣本標(biāo)準(zhǔn)差，bj第j個指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，其符號視測定值越大越好或越小越好而取正或負(fù)。j

本試驗(yàn)2個指標(biāo)同等重要，且脂肪酶活性（x1）、還原力（x2）都是越大越好，故權(quán)重系數(shù)分別為b1=l、b2=l，按以上公式計(jì)算綜合評分。

由表2可知，比較正交試驗(yàn)中極差（R值）的大小，可以看出4個因素的對櫻桃酵素發(fā)酵的影響大小依次為A（發(fā)酵時間）＞D（接種量）＞C（復(fù)合酶添加量）＞B（加糖量）。櫻桃酵素發(fā)酵條件優(yōu)化最優(yōu)處理組合為A2B1C1D3，即發(fā)酵時間為4 d，加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質(zhì)量比）為3∶1，復(fù)合酶添加量為300U/g、接種量為15%。在此條件下櫻桃酵素的脂肪酶酶活可達(dá)到1242U/mL，還原力吸光度值為0.680，相當(dāng)于1.63mg/mLVC標(biāo)準(zhǔn)溶液，具有較強(qiáng)的抗氧化性[14-16]。

表2 櫻桃酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for cheery enzyme fermentation process optimization

3 結(jié)論

水果酵素不僅保存了發(fā)酵原料中所固有的營養(yǎng)物質(zhì)，有些有效成分的含量還能夠大幅度增加，同時也產(chǎn)生了一些新的生物活性成分和生物酶。試驗(yàn)以櫻桃酵素的脂肪酶酶活和還原力為考察指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了櫻桃酵素的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，櫻桃酵素最佳發(fā)酵條件為復(fù)合酶添加量300 U/g、接種量15%、加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質(zhì)量比）3∶1、發(fā)酵時間4 d；在此條件下櫻桃酵素呈淺橙黃色、透明，帶有櫻桃香氣和淡淡的酒香。脂肪酶酶活可達(dá)到1242U/mL，還原力相當(dāng)于1.63mg/mLVC標(biāo)準(zhǔn)溶液。