翟苗苗，歐陽信，李夢茹，2，段 杉*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642；2.美國英狄士化學公司廣州代表處，廣東 廣州 510000）

香蕉是熱帶亞熱帶地區(qū)大量種植的水果，香蕉皮通常被當作垃圾丟棄，這不僅污染環(huán)境還造成資源的浪費。其實，香蕉皮中除了含有大量的果膠、粗纖維等多糖成分外，還含有維生素C、多酚以及K、Ca、Mg、S、Fe、Zn等多種礦物質[1]，此外，香蕉皮中還含有大量以糖苷形式存在的香氣前體成分等，值得開發(fā)利用。

水開菲爾粒是由乳桿菌為主，包括醋酸菌和酵母菌在內(nèi)的多種細菌和真菌共同構成的共生菌系，它們之間通過某些細菌分泌的多糖結合在一起形成顆粒[2]。世界上許多地區(qū)都有用水開菲爾粒發(fā)酵糖水、水果等制作飲料的習慣[3]，這些飲料在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量益生菌[4]、多糖、有機酸，具有抑制病原微生物[5]、抗炎[6]、提高免疫力[7]等功效。由于水開菲爾粒的菌系復雜，其發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生多種多樣的酶，對底物的水解作用更強，不僅能夠水解多糖類成分，也可以水解以糖苷形式存在的風味前體成分，釋放出誘人的果香，菌系自身也會產(chǎn)生復雜、協(xié)調的香氣成分，并產(chǎn)生各種具有保健功效的次級代謝產(chǎn)物，保健作用更強，發(fā)酵剩余的粗纖維等不溶性沉淀成分則可以用于制作膳食纖維。近年來的研究大多是關于香蕉皮中的功能性成分的提取與利用，鮮見采用香蕉皮發(fā)酵制作飲料的相關文獻。

本研究采用水開菲爾粒發(fā)酵香蕉皮，研究了發(fā)酵過程中各種成分的變化，旨在開發(fā)香蕉皮飲料，擴大香蕉皮的綜合利用途徑，提高香蕉深加工幅度，增加香蕉生產(chǎn)附加值，減少環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

香蕉皮、水開菲爾粒：市售；紅糖：廣東南字科技股份有限公司。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉：天津市大茂化學試劑廠；硫酸：廣州市東紅化工廠；酚酞：沈陽市試劑三廠；FL試劑（熒光素鈉）、2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2'-azobis（2-methylpropi onamidine）dihydrochloride，AAPH）、Trolox（水溶性維生素）：美國Sigma公司；磷酸氫二鉀：汕頭市光華化學廠；蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。實驗所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PB-10 pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；7890A-5975C氣相色譜質譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；101-1型電熱鼓風干燥箱：上海滬南科學儀器有限公司；JA2003電子天平：上海精密科學儀器有限公司；RHB80糖度計：上海精科實業(yè)有限公司；DPX-9082B-2電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O備公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉皮的發(fā)酵

將香蕉皮切成小塊后打漿，打漿后的香蕉皮分為兩份，一份在蒸鍋內(nèi)蒸15 min，破壞香蕉皮的組織結構，蒸煮后冷卻待用，另一份不做任何處理；按紅糖、香蕉皮、水、水開菲爾粒的質量比為1∶3∶10∶0.5發(fā)酵，其中，水開菲爾粒預先用無菌紗布包好，待用；紅糖預先與水按1∶10的比例配制好，然后煮沸5 min滅菌，冷卻。最后分別將上述兩份香蕉皮漿、紅糖水和水開菲爾?；旌?，裝入無菌三角瓶中，瓶口外覆8層紗布，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，至發(fā)酵液的pH不變時結束發(fā)酵。

采用烘干法測定香蕉皮發(fā)酵后剩余的沉淀物的干質量以及原料香蕉皮干質量，在105℃烘干至恒質量后，香蕉皮利用率計算公式如下：

1.3.2 分析檢測

采用pH計測定pH值；采用糖度計測定糖度；滴定酸度的測定按照國標GB5009.239—2016[8]《食品酸度的測定》中的酚酞指示劑法；乙醇含量的測定按照國標GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的濃縮果汁中乙醇的測定方法[9]?？寡趸钚缘臏y定按照續(xù)潔琨等[10]報道的氧化自由基吸收能力（oxygenradicalabsorbancecapacity，ORAC）法。分別按照國標GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測定方法》[11]、國標GB 4789.35—2016《乳酸菌檢驗》中的乳桿菌檢驗方法[12]、國標GB 4789.15—2016《霉菌和酵母計數(shù)方法》[13]檢測菌落總數(shù)、乳桿菌數(shù)量和真菌數(shù)量。

1.3.3 香蕉皮原料及發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風味成分的測定

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定香蕉皮原料及發(fā)酵液揮發(fā)性成分。

（1）揮發(fā)性氣體成分的收集

采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HP-SPME）法收集揮發(fā)性氣體成分，取10 mL未煮和煮過的香蕉皮發(fā)酵液分別置于萃取瓶中，萃取頭的材料型號為PDMA/DVB，將萃取頭插入萃取瓶中，使之懸空，萃取溫度45℃，萃取時間30 min，解吸時間15 min。在設定的條件下萃取得到揮發(fā)性氣體成分。

（2）香氣成分的測定

氣相色譜條件：DB-5色譜柱（30 m×0.25 nm×0.25 μm），載氣為氦氣（He），流速1.0mL/min，不分流進樣，恒壓35kPa，爐溫45℃，進樣口溫度250℃，起始溫度為35℃，保持5 min，后以3℃/min升溫至225℃，保持10 min。

質譜條件：離子源溫度230℃，電離方式電子電離（electronic ionization，EI），電子能量70 eV，燈絲電流150 μA，掃描質譜范圍33～450 amu。

定性定量方法：樣品經(jīng)過氣相色譜分離后，利用安捷倫質譜處理系統(tǒng)結合美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）11標準質譜庫對總離子流色譜圖中各峰進行檢索，確定每個峰對應的化合物，并用峰面積歸一法計算各化合物的相對含量。

2 結果與分析

2.1 香蕉皮發(fā)酵過程中的pH值和糖度變化

香蕉皮發(fā)酵過程中的pH值和糖度變化如圖1所示。

由圖1A可知，香蕉皮是否經(jīng)過蒸煮對發(fā)酵過程的pH值沒有影響，在0～48 h之間煮過和未煮過的香蕉皮發(fā)酵液的pH值下降迅速，從初始的5.47分別下降至3.90和3.87；之后二者下降很緩慢，到發(fā)酵結束時分別為3.53和3.51。

由圖1B可知，蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的糖度高于未蒸煮的，發(fā)酵結束時二者的糖度分別為2.7%和2.2%。推測香蕉皮煮過后組織結構被破壞，所含多糖等成分更易被水解釋放到發(fā)酵液中，導致蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的糖度更高。發(fā)酵液的糖度也是在0～48 h之間迅速下降，此后變化較小。結合圖1A可知，在0～48 h之間糖度變化與pH變化同步。水開菲爾粒中的微生物主要是各種乳桿菌，還有一些醋酸菌和酵母菌，乳桿菌會將大量糖類轉化為乳酸，一些乳酸菌還會利用環(huán)境中的糖合成構成開菲爾粒的多糖；酵母菌會將部分糖轉化為乙醇，醋酸菌則將乙醇進一步轉化為乙酸。推測在此時間范圍內(nèi)糖度迅速下降可能是由于微生物的代謝活動旺盛，大量產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸以及少量乙醇和多糖。到了發(fā)酵的中后期，糖度的變化較小，而pH持續(xù)緩慢下降，推測這是因為發(fā)酵初期產(chǎn)生的大量有機酸導致環(huán)境pH顯著下降，微生物的代謝活動被大大抑制，產(chǎn)生有機酸的速度大大降低所致；而糖度變化較小推測可能是由于一方面微生物消耗糖的速度大大降低，另一方面香蕉皮中的果膠等多糖類物質在發(fā)酵過程中緩慢發(fā)生水解，釋放出低分子糖類，這樣糖的消耗和產(chǎn)生基本持平。

圖1 香蕉皮發(fā)酵過程中的pH值(A)和糖度(B)變化Fig.1 Changes of pH value(A)and sugar contents(B)in banana peel during fermentation process

2.2 香蕉皮發(fā)酵液的成分分析

香蕉皮經(jīng)240 h發(fā)酵后，測定香蕉皮的利用率，并分析發(fā)酵液中各種成分含量，結果如表1所示。微生物指標測定結果見表2。

表1 香蕉皮利用率及發(fā)酵液的各種成分含量測定結果Table 1 Determination results of utilization rates of banana peel and the contents of various ingredients in fermentation broth

由表1可知，蒸煮香蕉皮利用率為43.8%，未蒸煮香蕉皮利用率為32.4%，可能是由于經(jīng)過蒸煮香蕉皮中的多糖、果膠等被釋放出來，更易于被細菌和真菌利用。蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的滴定酸度為54.9mmol/100mL，未蒸煮香蕉皮為50.9 mmol/100 mL，相差不大；蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中乙醇含量為2.8 mg/mL，低于未蒸煮香蕉皮7.9 mg/mL。

表2 香蕉皮發(fā)酵液的微生物指標測定結果Table 2 Determination results of microbiological indexes in fermentation broth of banana peel

由表2可知，二者的乳桿菌和細菌總數(shù)相差不大均在5.4～5.5 lg（CFU/mL）左右，而蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中真菌數(shù)為3.6 lg（CFU/mL），低于未蒸煮的4.0 lg（CFU/mL），水開菲爾粒發(fā)酵液中的真菌為酵母菌，故推測可能是由于蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中酵母菌數(shù)量較少，導致產(chǎn)生的乙醇較少。乳桿菌數(shù)與細菌菌落總數(shù)基本一致，可見在發(fā)酵液的微生物中乳桿菌占絕對優(yōu)勢，這與CORONAO等[14]的研究結果一致。

ORAC值反映抗氧化活性的強弱，蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的ORAC值為3.58mmolTrolox/L，低于未蒸煮香蕉皮5.03mmol Trolox/L，推測這是因為在蒸煮過程中香蕉皮原料中的天然抗氧化成分有所破壞導致，但仍有一定的抗氧化活性。

2.3 香蕉皮中揮發(fā)性成分分析

對香蕉皮原料及其發(fā)酵液的揮發(fā)性成分進行了分析，結果如表3所示。

表3 香蕉皮原料及其發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of volatile components in banana peel and its fermentation broth

由表3可知，從香蕉皮原料中共鑒定9種揮發(fā)性成分，分別為丁酸-2-甲基丙酯/丁酸異丁酯、丁酸丁酯、丁酸-1-甲基丁酯、3-甲基-丁酸丁酯/異戊酸丁酯、丁酸-3-甲基丁酯/丁酸異戊酯、3-甲基-丁酸-3-甲基丁酯/異戊酸異戊酯、2-甲基-丙酸己酯/異丁酸己酯、β-柏木烯、7,11-二甲基-3-亞甲基-1,6,10-十二碳三烯。這9種成分占全部揮發(fā)性成分的95.05%，而其中僅丁酸酯類就占92.05%，可見，香蕉皮原料的揮發(fā)性成分主要是丁酸酯類。

未蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中鑒定出9種揮發(fā)性成分，分別為乙酸、乙酸-3-甲基丁酯/乙酸異戊酯、芳樟醇、辛酸/羊脂酸、辛酸乙酯、2-莰烯、乙酸苯乙酯、突厥烯酮、癸酸乙酯。其含量占全部揮發(fā)性成分的87.13%。從蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中檢出28種揮發(fā)性成分，鑒定出其中的9種，分別為乙酸、乙酸-3-甲基丁酯/乙酸異戊酯、芳樟醇、辛酸/羊脂酸、辛酸乙酯、2-莰烯、乙酸苯乙酯、突厥烯酮、2,5-二叔丁基酚。其含量占全部揮發(fā)性成分的83.49%。在鑒定出的揮發(fā)性成分中，未蒸煮和蒸煮香蕉皮僅有1種成分不同，且其占比僅略超過1%，這說明二者的揮發(fā)性成分是相近的。

由表3可知，從香蕉皮原料中鑒定出的9種揮發(fā)性成分經(jīng)過發(fā)酵后全部消失，說明發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的變化很大，感官評定也表明香蕉皮經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生了濃郁的水果香氣，與原料的氣味差異極大。陶晨等[15]從香蕉中鑒定出39種揮發(fā)性成分，其中酯類占66.99%，包括異戊酸2-甲基丁酯、丁酸異戊酯和丁酸己酯等，與本研究結果相似。張文燦等[16]發(fā)現(xiàn)乙酸異戊酯在香蕉果肉和果皮中分別占揮發(fā)性成分的27.23%和4.67%，本研究在香蕉皮原料中未檢測到乙酸異戊酯，但在未蒸煮和蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中檢測到其含量分別達到34.15%和15.76%，除乙酸外，含量占第一位，推測該成分在香蕉皮原料中可能以糖苷類香氣前體成分的形式存在，無揮發(fā)性，發(fā)酵后游離出來。本研究在香蕉皮原料中檢測到的丁酸異丁酯（2.15%）、丁酸丁酯（6.34%）、丁酸-1-甲基丁酯（17.20%）、丁酸異戊酯（65.40%）等幾種主要揮發(fā)性成分也均在張文燦等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，但含量不同，這可能與成熟度、品種等差異有關。乙酸苯乙酯未在香蕉皮原料中檢出，但在未蒸煮和蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中除乙酸外其含量占第二位，分別達到5.78%和10.00%。

前期研究[17]發(fā)現(xiàn)在水開菲爾粒的微生物群落中存在多種多樣的糖苷酶基因，而大量的水果香氣成分是以糖苷類的前體物形式存在的，推測用水開菲爾粒發(fā)酵香蕉皮，可以有效水解糖苷類物質，將大量的香氣成分釋放出來，獲得良好的水果香氣，本實驗結果證實了這種推測。

水開菲爾粒中的糖苷酶也包括了水解果膠、纖維素等物質的糖苷酶，所以香蕉皮經(jīng)過發(fā)酵后相當一部分固形物被水解釋放到發(fā)酵液中。發(fā)酵剩余的殘渣主要是香蕉皮中的纖維素一類的成分，經(jīng)過清洗干燥可以作為膳食纖維補充劑。

3 結論

本研究通過用水開菲爾粒對蒸煮和未蒸煮香蕉皮發(fā)酵，探討香蕉皮發(fā)酵過程中各種成分的變化。氣相色譜-質譜聯(lián)用的數(shù)據(jù)結果顯示香蕉皮發(fā)酵前后香氣成分變化極大，發(fā)酵后香氣大大增強。盡管蒸煮香蕉皮的發(fā)酵液比未蒸煮抗氧化活性有所降低，但仍具有一定的抗氧化活性，而且蒸煮香蕉皮利用率43.8%高于未蒸煮香蕉皮32.4%，乙醇含量2.8 mg/mL低于未蒸煮香蕉皮7.9 mg/mL。水開菲爾粒發(fā)酵蒸煮香蕉皮，發(fā)酵液風味良好，類似果醋，有望進一步開發(fā)成為新型飲料。