王永娟

摘 要：臍血作為一種造血干細(xì)胞來(lái)源可替代骨髓進(jìn)行造血干細(xì)胞移植， 臍血移植在治療兒童遺傳性疾病和血液病方面取得了巨大的成效。為進(jìn)一步推廣臍血移植，必須相應(yīng)地建立起完備的臍血庫(kù)。臍血庫(kù)不同于骨髓庫(kù)， 它必須凍存實(shí)物。為減少凍存體積， 降低成本， 需要采取有效的方法分離臍血中有核細(xì)胞， 從而使大規(guī)模、廣泛地建立臍血庫(kù)成為可能。本文對(duì)臍血造血干細(xì)胞分離進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究分析。

引言

臍帶血（umbilical cord blood，UCB） 是產(chǎn)后留存在胎盤和臍帶中的血液， 以往被作為醫(yī)學(xué)廢物而丟棄。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶中存在大量間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能， 可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干/祖細(xì)胞， 可用于造血干細(xì)胞移植，治療多種疾病。

一、試驗(yàn)方法

1.1臍帶血造血干細(xì)胞分離

利用離心沉降法和自然沉降法分離臍帶血有核細(xì)胞，計(jì)算有核細(xì)胞回收率和紅細(xì)胞回收率，比較兩種分離方法的分離效果。

離心沉降法：將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1∶5的比例混合，慢速搖勻10min，以50g、10℃離心7min，收集上層富白細(xì)胞血漿，再以400g、10℃離心15min，去除血漿。

自然沉降法：將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1：5的比例混合，慢速搖勻10min，懸掛讓其內(nèi)細(xì)胞自然沉降1h后，收集上層富白細(xì)胞血漿，同樣以400g、10℃離心15min，去除血漿。

1.2臍帶血造血干細(xì)胞凍存

將分離后的臍帶血分別與4種不同的冷凍保護(hù)劑混合，臍帶血與冷凍保護(hù)劑的體積比為4∶1，混合時(shí)應(yīng)將冷凍保護(hù)劑緩慢注入臍帶血中，邊注入邊晃動(dòng)。用程控降溫儀按以下程序降溫，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降溫至-40℃，再以-10℃/min的速率降溫至-80℃，完成后將臍帶血混合物放入液氮罐中儲(chǔ)存。4種冷凍保護(hù)劑分別為：DMSO和0.9%氯化鈉溶液1∶1混合液，DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液，DMSO和6%羥乙基淀粉1∶1混合液，DMSO、胎牛血清和F12培養(yǎng)基9∶4∶5混合液。冷凍保護(hù)劑新鮮配制并于4℃提前預(yù)冷。

1.3凍存后復(fù)蘇

臍帶血凍存3個(gè)月后，將凍存的臍帶血在37℃水浴鍋中復(fù)蘇，測(cè)細(xì)胞存活率，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行造血干細(xì)胞表面標(biāo)志等分析，并進(jìn)行祖細(xì)胞集落培養(yǎng)，從而比較4種冷凍保護(hù)劑的凍存效果的差異性。

1.4存活率檢測(cè)

取100μL臍帶血樣品，加入900μL氯化銨溶血素，4℃避光反應(yīng)5min，200g離心5min，棄上清加入細(xì)胞重懸液900μL重懸，再取50μL混合液加入臺(tái)盼藍(lán)2X溶液50μL，靜置3min后計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品至少數(shù)300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算有核細(xì)胞存活率。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)

計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞是檢驗(yàn)造血干細(xì)胞活性的公認(rèn)方法之一。取50μL臍帶血樣品，加入小鼠抗人CD34-PE、CD45-FITC抗體各10μL，室溫避光孵育20min，然后加入300μL溶血素避光反應(yīng)15min，最后加入300μL鞘液避光靜置3min，待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6祖細(xì)胞集落培養(yǎng)

集落形成分析是一種檢驗(yàn)造血干祖細(xì)胞活性公認(rèn)的敏感方法。取100μL臍帶血樣品，加入900μL氯化銨溶血素，4℃避光反應(yīng)5min，200g離心5min，棄上清后加入1mLIMDM洗滌2次，加入200μLIMDM重懸，取適量細(xì)胞加入甲基纖維素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中細(xì)胞終濃度1×105cells/mL，混勻培養(yǎng)基后平分為2份加入到24孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后分別對(duì)CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.7凍存時(shí)間對(duì)臍帶血造血干細(xì)胞的影響

選擇上述研究中最佳冷凍保護(hù)劑，采用相同的試劑和方法，比較同一份臍帶血樣本凍存前、凍存3個(gè)月、6個(gè)月和一年的存活率、有核細(xì)胞數(shù)、CD34+造血干細(xì)胞數(shù)、祖細(xì)胞集落數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測(cè)定結(jié)果均按平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，顯著性水平為P<0.05。

二、試驗(yàn)結(jié)果

2.1有核細(xì)胞分離效果

離心沉降法有核細(xì)胞回收率為83.60%±9.44%，自然沉降法有核細(xì)胞回收率為86.40%±8.49%，二者之間差異無(wú)顯著性意義（P>0.05），但離心沉降法所需時(shí)間更短，操作簡(jiǎn)便，更適合臍帶血庫(kù)。

2.2復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率和存活率

4種凍存液凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率和存活率結(jié)果見表1。結(jié)果表明：第4種冷凍保護(hù)劑凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率與前3種的差異有極顯著意義（P<0.01），且數(shù)據(jù)偏低不能達(dá)到要求；第1，2，3種冷凍保護(hù)劑復(fù)蘇有核細(xì)胞回收率的差異無(wú)顯著意義（P>0.05）；4種冷凍保護(hù)劑復(fù)蘇細(xì)胞存活率的差異有極顯著意義（P<0.01），其中第2種和第3種差異不顯著，復(fù)蘇后存活率最佳。

2.3復(fù)蘇后流式分析和祖細(xì)胞培養(yǎng)

4種冷凍保護(hù)劑凍存的細(xì)胞復(fù)蘇流式分析和祖細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果見表2。4種冷凍保護(hù)劑冷凍的細(xì)胞復(fù)蘇CD34+回收率和祖細(xì)胞回收率的差異均有極顯著意義（P<0.01），其中第2種和第3種差異不顯著，流式CD34+和祖細(xì)胞回收率最高。

三、結(jié)果與討論

分離臍帶血造血干細(xì)胞方法常采用分選法、羥乙基淀粉沉淀法和密度梯度離心法。由于目的不同，各類方法有其自身特點(diǎn)。分選法使用磁珠或流式細(xì)胞配合相應(yīng)單克隆抗體分離得到較純的細(xì)胞群體，但細(xì)胞回收率較低，且成本昂貴，適合對(duì)細(xì)胞純度要求較高的研究； 密度梯度離心法多采用Percoll、Ficoll 分離液分離細(xì)胞，得到單個(gè)核細(xì)胞群，但純度不高； 羥乙基淀粉沉淀法，分離的細(xì)胞量大、成分較多但紅細(xì)胞含量高，適合臍帶血庫(kù)等用于大量分離儲(chǔ)存干細(xì)胞。本研究對(duì)臍帶血庫(kù)常用的羥乙基淀粉自然沉降法和離心沉降法的有核細(xì)胞回收率進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，離心沉降法效率更高。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉獻(xiàn)志，劉紫輝，楊波.臍血造血干細(xì)胞分離方法的實(shí)驗(yàn)研究[J].醫(yī)藥論壇雜志，2007（05）：52-54.