周 潔，丁 鵬,c，汪桂宇，許 威,c，童華榮，崔繼來,c*

(1.信陽師范學(xué)院 a.生命科學(xué)學(xué)院；b.河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽 464000;2.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 北碚 400716)

0 引言

香氣是茶葉最重要的品質(zhì)之一.茶葉中的香氣物質(zhì)含量微少，只占茶葉干重的0.02%左右，但是種類繁多.迄今為止，已經(jīng)從各類茶葉中分離出600多種香氣物質(zhì)[1].茶葉的香氣成分主要為脂類衍生物、芳香族衍生物、萜類衍生物以及含氮、氧、硫雜環(huán)類化合物.茶葉的香氣有一部分是在鮮葉生長過程中合成的，另一部分則是在加工過程中轉(zhuǎn)化形成.香氣物質(zhì)除了以游離態(tài)形式存在外，更多的則是以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在于茶葉中.糖苷類香氣前體物質(zhì)(Glycosidically bound aroma precursors)是一類不具揮發(fā)性，與糖類物質(zhì)通過糖苷鍵結(jié)合，以糖苷形式存在的香氣前體物質(zhì).茶樹在生長發(fā)育過程中形成了大量的糖苷類香氣前體物質(zhì)，茶樹新梢在失水、離體、蟲咬、病菌侵染等脅迫環(huán)境下，糖苷類物質(zhì)容易發(fā)生水解，釋放出苷元，這些苷元構(gòu)成茶葉香氣品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)[2].本文對茶葉中已發(fā)現(xiàn)的糖苷類香氣物質(zhì)的種類、糖苷類香氣物質(zhì)的分析方法進(jìn)行了探討，并結(jié)合加工中糖苷類物質(zhì)含量的變化對茶葉香氣形成的可能作用進(jìn)行了分析.

1 茶葉中糖苷類香氣前體的種類

1981年,TADAKAZU[3]在研究茶葉香氣形成時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)茶鮮葉勻漿時(shí)有揮發(fā)性物質(zhì)如芳樟醇、香葉醇等產(chǎn)生，將鮮葉蒸青后再培育就沒有揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生，向蒸青鮮葉勻漿中添加外源性葡萄糖苷酶時(shí)有揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生，這一過程會(huì)被Hg+和D-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯(葡萄糖苷酶抑制劑)抑制，這些香氣物質(zhì)可能以葡萄糖苷的形式存在于茶鮮葉中.1990年YANO等[4]將茶鮮葉粗酶提取物加入到綠茶熱水提取物中，在37 ℃下酶解后檢測到順-3-己烯醇、芳樟醇氧化物 I、芳樟醇、水楊酸甲酯、苯甲醇和苯乙醇，同時(shí)證明了香葉基-β-D-葡萄糖苷是香葉醇的前體.從1990年起，20余種不同的糖苷從不同的茶樹鮮葉或成品茶中提取出來[5-13].按照糖基不同(圖1)，這些糖苷分為單糖苷,如吡喃葡萄糖苷(β-D-glucopyranoside)；雙糖苷，如櫻草糖苷(Primerveroside, 6-O-β-D-xylopyranosyl-β-D-glucopyranoside)、巢菜糖甙 (Vicianoside,6-O-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside)和Acuminoside (6-O-β-D-apiofuranosyl-β-D-glucopyranoside).按照配基的類型不同(圖2)，這些糖苷可以分類為：配基為脂肪醇類，如順-3-己烯基糖苷；配基為芳香醇類，如苯甲基糖苷和2-苯乙基糖苷；配基為萜烯醇及其衍生物，如香葉醇糖苷、芳樟醇糖苷、芳樟醇氧化物糖苷.YANG等[14]從日本茶樹品種鮮葉中檢測出了香豆素，并發(fā)現(xiàn)香豆素在鮮葉中主要以游離態(tài)形式存在，少量以香豆素櫻草糖苷形式存在.Kinoshita等[15]發(fā)現(xiàn)β-大馬烯酮以葡萄糖苷的形式在于綠茶中.

圖1 茶葉中發(fā)現(xiàn)的4種主要糖苷類型Fig. 1 Four types of main glycosides found in tea plants

圖2 茶葉中發(fā)現(xiàn)糖苷的主要苷元Fig. 2 Main aglycones of glycosides found in tea

2 茶葉中參與糖苷水解的酶

茶葉中的糖苷類香氣前體要在酶的參與下才能釋放出揮發(fā)性香氣成分，目前已經(jīng)分別從C.sinensisvar. Yabukita[16]和C.sinensis(L.) O. Kuntze[17]中鑒定出了β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶兩種糖苷水解酶.從茶樹中發(fā)現(xiàn)了20多種β-葡萄糖苷酶基因，分別屬于GH1、GH3和GH5糖基水解酶家族，這些β-葡萄糖苷酶定位于細(xì)胞的不同部位，對于茶葉的香氣形成可能起著不同的作用[18].β-葡萄糖苷酶可以促使葡萄糖苷類香氣前體釋放，生成香氣物質(zhì)[19,20].張正竹等[21]從茶樹鮮葉中分離出的兩個(gè)β-葡萄糖苷酶單體酶，可以水解順-3-己烯醇、苯甲醇和苯乙腈的β-D-葡萄糖苷,通過水解葡萄糖苷的形式參與茶葉香氣的形成.

β-櫻草糖苷酶也是參與糖苷類香氣前體水解的重要酶，因?yàn)椴枞~中的糖苷主要以櫻草糖苷的形式存在.研究表明β-櫻草糖苷酶屬于糖基水解酶，且50%～60%的蛋白序列與β-葡萄糖苷酶相同[16].β-櫻草糖苷酶不能水解葡萄糖苷，只能專一性地水解櫻草糖苷上糖基和配基之間的糖苷鍵[16].重組的β-櫻草糖苷酶與茶葉中β-櫻草糖苷酶顯示出了一致的底物專一性[22].與茶葉糖苷類香氣化合物的分布一致，β-櫻草糖苷酶的活性和含量在嫩度較高的鮮葉中較高，隨著茶葉的成熟逐漸降低[16].此外，β-櫻草糖苷酶定位在細(xì)胞壁和細(xì)胞間腔區(qū)，而糖苷類香氣化合物存在于液泡[16]，這意味著，在正常條件下，酶和底物是不會(huì)相互接觸而發(fā)生水解作用的.當(dāng)茶鮮葉在各種脅迫條件下，β-櫻草糖苷酶能夠接觸糖苷類香氣前體，發(fā)生水解反應(yīng)，釋放相應(yīng)的揮發(fā)性香氣化合物.

3 糖苷類香氣前體定性定量分析方法

由于糖苷類香氣前體物質(zhì)揮發(fā)性低，不易氣化，所以對糖苷的分析多采用間接的方法，用衍生法將糖苷變成易揮發(fā)的物質(zhì)進(jìn)行分析，或?qū)⑻擒账夥謩e分析釋放出的糖基和揮發(fā)性配基.

3.1 水解法

糖苷可以在酸性條件或者通過糖苷水解酶發(fā)生水解，釋放出糖基和配基(圖3)，然后對糖基和配基分別進(jìn)行分析，從而得到糖苷的結(jié)構(gòu)和含量等信息.對于葡萄中的糖苷分析多采用酸水解的方式，在酸性條件下，糖苷釋放出配基和糖基，然后用氣相色譜(Gas chromatography, GC)或氣質(zhì)聯(lián)用(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析揮發(fā)性配基，用葡萄糖氧化酶試劑盒(Glucose Oxidase Activity Assay Kit)或其他方式分析糖基部分.由于采用這種方法只能得到糖苷糖基或配基總量的信息，同時(shí)糖苷水解出的單萜醇在酸性條件下可能存在結(jié)構(gòu)變化的情況(圖4)[23]，這些局限性限制了水解法分析糖苷的應(yīng)用.目前這種方法在分析葡萄酒香氣前體物質(zhì)的時(shí)候應(yīng)用較多[24].

圖3 櫻草糖苷水解釋放出配基示意圖 Fig. 3 Schema of releasing aglycones from primverosides by hydrolysis

圖4 萜烯醇在酸性條件下發(fā)生的分子重排Fig. 4 Rearrangement of monoterpenes under acidic condition

3.2 酶解法

對茶葉中糖苷的水解多采用酶解法，用于水解的酶多是采用從茶樹鮮葉中提取的酶.由于茶葉中的多酚類物質(zhì)是葡萄糖苷水解酶的抑制劑，將酶加入糖苷前需要初步將糖苷提純或用其他方法(醋酸鉛或聚乙烯聚吡咯烷酮)除去鮮葉中的多酚.通過對糖苷水解釋放出的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)包括芳樟醇、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物等.

廖淑娟等[25]將提取的粗酶加入到提取的糖苷中，從釋放的揮發(fā)性香氣物質(zhì)中檢測到苯甲醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物、苯乙醇、水楊酸甲酯、橙花醇、香葉醇橙花叔醇等.RAWAT等[26]從茶芽中純化得到一種β-葡萄糖苷酶，用它來水解糖苷，釋放出香葉醇、芳樟醇、苯乙醇、苯甲醇等香氣成分.

3.3 衍生法

通過N-甲基-雙(三氟乙酰胺)(N-methyl bis (trifluoroacetamide)，MBTFA)可以將糖苷變成易揮發(fā)的三氟乙酸衍生物(圖5)，從而能夠通過GC或GC-MS進(jìn)行分析.在用GC-MS分析時(shí)，由于形成的三氟乙酰胺衍生物會(huì)在電子電離(Electron impact ionization)作用下形成特征性離子碎片，GC-MS質(zhì)譜圖中不會(huì)出現(xiàn)其分子峰，只能根據(jù)裂解的碎片進(jìn)行定性分析，因此很容易受到其他碎片干擾.

圖5 糖苷衍生產(chǎn)生的衍生物Fig. 5 Derivative of glycoside after derivatization

WANG等[27]以合成的糖苷類香氣前體做標(biāo)品，將從茶葉中分離純化的粗糖苷在無水嘧啶中和MBTFA發(fā)生衍生化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60 ℃，時(shí)間為30 min，然后用GC-MS分析形成的糖苷衍生物，建立了茶葉中的26種糖苷類香氣前體物質(zhì)的分析方法.谷勛剛等[28,29]優(yōu)化了上述衍生條件，發(fā)現(xiàn)在60 ℃下反應(yīng)50 min效果更好.同時(shí)他們還用GC結(jié)合電子捕獲檢測器(electron capture detector, ECD)對糖苷衍生后的氟化物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明在0.05～200 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，對6種糖苷的GC-ECD法測定也具有良好的重現(xiàn)性，與GC-MS法相比，GC-ECD法顯著降低了檢測限(Limitation of detection, LOD).

3.4 直接定量法

目前，國內(nèi)關(guān)于茶葉中糖苷類香氣物質(zhì)的研究已經(jīng)從新糖苷的發(fā)現(xiàn)開始轉(zhuǎn)向分析糖苷在加工過程中的變化，分析手段也從單一的水解或衍生后采用GC-MS分析轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯硬捎靡嘿|(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析.由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，使糖苷類香氣前體物質(zhì)的直接定性定量分析變得困難，茶葉工作者在糖苷類物質(zhì)合成方面也有進(jìn)展，成功合成了香葉基-β-D-葡萄糖苷[30]，苯甲基-β-D-葡萄糖苷[31]，2-苯乙基-β-D-葡萄糖苷[31]，玫瑰醇β-D-葡萄糖苷[32]，順-3-己烯基-β-D-葡萄糖苷[33]等，對茶葉中糖苷的直接定性定量分析具有積極作用.

使用新的分析手段使科研工作者在茶葉化學(xué)領(lǐng)域的研究變得更有效，取得更多成果.張正竹等[34]采用液質(zhì)連用與氣相色譜結(jié)合的方法對櫧葉種鮮葉中的糖苷進(jìn)行分析，根據(jù)對糖苷經(jīng)酶水解后釋放出配基的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)糖苷中主要的苷元有順-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物(I 、II)、香葉醇、水楊酸甲酯、苯甲醇和2-苯乙醇等，結(jié)合液質(zhì)得到的分子量信息，鑒定出了9種糖苷類香氣前體物質(zhì)，包括1種單糖苷和8種雙糖苷.朱圣潔等[35]在此基礎(chǔ)上采用HPLC-ESI-MSn結(jié)合GC-MS分析鑒定了綠茶中13種糖苷類香氣前體物質(zhì)，包含3種單糖苷和10種雙糖苷，其中2種糖苷(氧化芳樟醇I 和II 的葡萄糖苷)首次發(fā)現(xiàn)存在于綠茶中.

CUI等[36]以10種糖苷類香氣物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)物，建立了采用固相萃取(Solid phase extraction, SPE)凈化與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)的糖苷直接分析方法.該方法采用的固相萃取柱能夠從茶葉提取物中去除干擾物的同時(shí)保留糖苷，有效地凈化了茶葉提取物再進(jìn)一步分析.在65 min內(nèi)完成10種糖苷的定性定量分析，具有樣品量小(50 mg)、前處理簡單、效率高等特點(diǎn).各種糖苷在5～100 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2> 99%).

SCHNEIDER等[37]開發(fā)了一種FT-IR(Fourier-transform infrared spectrometry，傅立葉變換紅外光譜法)分析糖苷的方法，得到了同一個(gè)葡萄品種39個(gè)不同成熟度樣品的FT-IR圖譜，同時(shí)采用酶解法間接測定樣品中糖苷的含量，發(fā)現(xiàn)在特定波長下樣品的吸光度與C13-降異戊二烯糖苷和單萜醇糖苷含量相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到94%和90%，但是其他類糖苷含量的相關(guān)性較低(76%～87%)，與酸類的糖苷沒有相關(guān)性(11%).

4 茶葉中糖苷類香氣前體與茶葉香氣形成

由于茶葉中糖苷水解是茶葉香氣形成的重要途徑之一，國內(nèi)外研究者對這一過程進(jìn)行了深入的研究，并取得了一系列成果.向櫧葉群體種鮮葉中添加香氣釋放劑，大量萜烯醇及其氧化物得到釋放，并且釋放量都高于原鮮葉中對應(yīng)香氣物質(zhì)的含量，表明大量的萜烯醇類在茶樹鮮葉中以鍵合態(tài)的形式存在，在茶葉加工過程中可以通過一定手段促進(jìn)鍵合態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)化，從而改善茶葉的品質(zhì).張正竹等[38]成功從櫧葉種茶樹鮮葉中分離了橙花醇β-D-葡萄糖苷，與化學(xué)合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對得到驗(yàn)證.

茶樹鮮葉中的糖苷類香氣前體的含量隨空間和時(shí)間的改變而發(fā)生變化.苗愛清等[39]發(fā)現(xiàn)黃棪新梢中無論是香氣還是糖苷香氣前體含量莖多于梢，多于葉.張正竹等[40]發(fā)現(xiàn)在春茶中單萜烯醇糖苷含量特別是香葉醇糖苷含量很高，秋茶中以脂肪族醇、芳香族醇、酯為苷元的糖苷含量顯著增加，單萜烯醇糖苷含量降低，夏茶中水楊酸甲酯、苯甲醇糖苷處于低水平而苯乙醇糖苷含量較高.通過對糖苷類香氣前體在茶葉中不同部位的分布和季節(jié)性變化的研究，對有效綜合利用茶原料(如茶梗[41])，改善夏秋茶品質(zhì)具有重要意義.

茶樹品種繁多，茶樹品種中糖苷的種類和含量也不盡相同.廖書娟等[25]分析了16個(gè)不同茶樹品種鮮葉中脂肪酸和糖苷類香氣前體的含量，發(fā)現(xiàn)不同品種間脂肪酸的含量沒有明顯規(guī)律，而適制烏龍茶的品種糖苷類物質(zhì)含量較高，適制綠茶的品種糖苷類物質(zhì)含量較低.翁貴鳳[42]分析了農(nóng)星系列3個(gè)茶樹新品系的糖苷類香氣前體物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)適制烏龍茶的品系都含有豐富的糖苷類香氣前體物質(zhì).RAWAT等[43]研究了印度不同品種的茶樹中糖苷的種類和含量，發(fā)現(xiàn)不同品種茶樹的萜烯指數(shù)和香氣指數(shù)存在顯著差異.這些結(jié)果表明存在將糖苷類物質(zhì)含量作為茶樹品種適制性新指標(biāo)的可能性，在早期就能進(jìn)行茶樹品種適制性的篩選.

糖苷類香氣前體在加工過程中會(huì)發(fā)生水解，釋放出香氣成分，糖苷在茶葉加工過程中的變化一直是茶葉工作者研究的焦點(diǎn).魏志文等[44]研究了紅茶和綠茶加工工藝對茶樹鮮葉香氣和糖苷香氣前體的影響，發(fā)現(xiàn)相同原料做出的紅茶和綠茶在香氣和糖苷香氣前體的成分和含量上存在顯著差異，在綠茶中檢測到了鮮葉6種前體苷元中的5種，紅茶中只檢測出了2種，而紅茶中精油的相對含量分別是鮮葉和綠茶的2倍和6倍多.同時(shí)還發(fā)現(xiàn)綠茶加工中，僅占鮮葉20.3%的糖苷苷元被釋放出來，而紅茶加工過程中95.6%的糖苷苷元得以釋放.GUO等[45]也發(fā)現(xiàn)將陳綠茶與茶鮮葉混勻發(fā)酵會(huì)生產(chǎn)出工夫紅茶的品質(zhì)特征.張正竹等[40, 46]發(fā)現(xiàn)在茶鮮葉攤放過程中糖苷的總量會(huì)增加，在后續(xù)加工階段逐漸降低，成品綠茶中仍保留了約77%的糖苷類香氣前體.這些研究表明成品綠茶中存在相當(dāng)數(shù)量的香氣前體物質(zhì)，為進(jìn)一步通過改進(jìn)加工方式來增強(qiáng)綠茶香氣提供理論基礎(chǔ)和依據(jù).

WANG等[47,48]研究了紅茶和烏龍茶加工過程中糖苷類香氣前體的變化，結(jié)果表明紅茶加工過程中櫻草糖苷降解主要發(fā)生在揉捻階段，發(fā)酵后櫻草糖苷幾乎消失，葡萄糖苷在紅茶加工過程中的含量保持穩(wěn)定.而在烏龍茶加工過程中糖苷的含量從日光萎凋階段就開始增加，在成品茶中達(dá)到最高.紅茶和烏龍茶加工過程中含量變化的差異表明了糖苷作為香氣前體物質(zhì)在紅茶和烏龍茶香氣形成中的不同作用，從而形成了紅茶和烏龍茶的不同香氣特征.

謝運(yùn)海等[49]和趙飛[50]采用沸乙醇法分別提取漳平水仙茶和立頓綠茶中糖苷類香氣前體物質(zhì)，再經(jīng)雙相酶解法釋放香氣物質(zhì)，鑒定出漳平水仙茶中含有青葉醇、芳樟醇、水楊酸甲酯、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇等6種糖苷類香氣前體.同時(shí)發(fā)現(xiàn)秋茶中糖苷類香氣前體的含量明顯較春茶的高；晾青葉中糖苷類香氣前體含量顯著增加，搖青中糖苷類香氣前體含量發(fā)生波動(dòng)，說明在做青過程中存在著糖苷合成與酶解的動(dòng)態(tài)平衡.趙飛也發(fā)現(xiàn)烏龍茶搖青過程中糖苷的含量發(fā)生波動(dòng)[50].

5 展望

在茶葉加工過程中，糖苷類香氣前體物質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性香氣物質(zhì)，如何更好地將這部分結(jié)合態(tài)香氣釋放出來，提高茶葉香氣品質(zhì)，已成為目前茶葉加工制品香氣研究的重點(diǎn).國內(nèi)外研究表明，茶葉中存在含量較為豐富的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)，通過水解的方法，解離出茶葉中的鍵合態(tài)芳香組分，釋放潛在的芳香物質(zhì)，是提高茶葉香氣品質(zhì)的有效方法.SU等[51]采用交聯(lián)-包埋-交聯(lián)的方法將β-葡萄糖苷酶固化在海藻鹽上，然后將其應(yīng)用在茶飲料中，發(fā)現(xiàn)固化酶能顯著提高茶飲料的香精油總量(綠茶，20.69%，烏龍茶10.3%，紅茶6.79%).因?yàn)椴枞~中主要的糖苷類香氣前體是櫻草糖苷，采用櫻草糖苷處理茶飲料應(yīng)該能夠釋放更多的揮發(fā)性香氣物質(zhì).由于受成本等因素影響，采用固化酶提高茶飲料香氣的研究多停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，實(shí)際工業(yè)應(yīng)用仍較少，如何更好、更有效、更經(jīng)濟(jì)地在茶飲料生產(chǎn)中運(yùn)用這一技術(shù)，成為提高茶飲料香氣品質(zhì)的重點(diǎn)和難點(diǎn).

由于受到缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的限制，現(xiàn)在對茶葉中糖苷類香氣前體的研究多停留在先提取然后水解，分析釋放出的揮發(fā)性苷元.由于缺乏對茶葉中糖苷類香氣前體的直接分析，使研究者從糖苷的分析結(jié)果中得到不準(zhǔn)確的結(jié)論.比如，研究者從適制烏龍茶的茶樹品種鮮葉中提取出多種糖苷，并將其視為香氣前體，并在加工過程中形成揮發(fā)性香氣成分.但CUI等[36]和GUI等[52]最近的研究成果都表明糖苷在烏龍茶加工過程中并未發(fā)生水解，糖苷的含量在加工過程中并沒有發(fā)生減少，烏龍茶的香氣是通過別的途徑形成的.因此，如何優(yōu)化糖苷的合成方法，如何高效、經(jīng)濟(jì)地合成各種糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，也是今后開發(fā)研究的重要目標(biāo).

糖苷類香氣前體物質(zhì)除了能夠水解釋放出香氣參與茶葉香氣形成外，還具有其他功能，如SUGIMOTO等[53]發(fā)現(xiàn)(Z)-3-hexenol會(huì)參與番茄植株之間的信號(hào)傳遞，健康植株能夠吸收受侵害植株釋放出的(Z)-3-hexenol并形成(Z)-3-hexenyl-vicianoside，從而增強(qiáng)對害蟲的抵抗.國內(nèi)學(xué)者的研究成果也表明茶葉中的糖苷會(huì)由病蟲害誘導(dǎo)發(fā)生水解，參與防御體系，但作用機(jī)制仍不清楚.因此，探索茶樹中糖苷類物質(zhì)參與信號(hào)傳導(dǎo)與防御反應(yīng)的機(jī)制，對茶樹抗病優(yōu)良品種選育、茶園管理技術(shù)等都有重要的意義.