朱丹丹,周新華,鄭常格,蒲 俠
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,廣東 廣州 510225;2.廣州市生物防治站,廣東 廣州 510460)
甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),又名為貪夜蛾,俗稱白菜褐夜蛾,屬于鱗翅目夜蛾科,主要危害十字花科、茄科、豆類等蔬菜[1]。近年來對(duì)蘿卜、棉花等作物的危害越加嚴(yán)重[2-3],農(nóng)戶為減輕蟲害,長(zhǎng)期使用毒性較高的化學(xué)藥劑進(jìn)行防治,而且用量和用藥次數(shù)不斷增加,從而導(dǎo)致甜菜夜蛾抗性水平快速上升,防治效果下降的同時(shí)也對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全產(chǎn)生影響[4]。為了找到綠色環(huán)保防治甜菜夜蛾蟲害的方法,科研人員進(jìn)行了多種試驗(yàn):王春蘭等[5]使用乙基多殺菌素等幾種低毒藥劑檢測(cè)對(duì)蘿卜甜菜夜蛾的田間藥效,孟祥坤等[6]通過大田試驗(yàn)驗(yàn)證了高毒力菌株對(duì)花生甜菜夜蛾的防治效果,楊建云等[7]用組建生命表的方法評(píng)價(jià)了粘質(zhì)沙雷氏菌菌株P(guān)S-對(duì)甜菜夜蛾試驗(yàn)種群增長(zhǎng)的抑制作用。上述幾種方法探討了低毒藥劑和生物病菌對(duì)甜菜夜蛾的防治作用,其中單純使用生物防治手段的方法雖然有針對(duì)性強(qiáng)、環(huán)保無毒的優(yōu)點(diǎn),但因?yàn)樯镛r(nóng)藥的起效慢,價(jià)格昂貴,因而很難在市場(chǎng)中推廣[8],且前人大多只進(jìn)行了毒力試驗(yàn),并沒有對(duì)生物農(nóng)藥劑型進(jìn)行開發(fā)。甜菜夜蛾核型多角體病毒是一種能有效防治甜菜夜蛾的病原微生物[9],湯歷等[10]研制了一種環(huán)境友好型農(nóng)藥制劑1×109PIB/mL甜菜夜蛾核型多角體病毒懸浮劑為seNPV水基制劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選用核型甜菜夜蛾多角體病毒(seNPV)與低毒高效的甲維鹽進(jìn)行復(fù)配,進(jìn)行水懸浮劑的初步研制,期望通過生物化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配使用克服生物農(nóng)藥起效慢,成本高的缺點(diǎn),為甜菜夜蛾的防治提供一種新的選擇。
供試甜菜夜蛾來源于廣州市生物防治站昆蟲培養(yǎng)室,在實(shí)驗(yàn)室從蟲卵飼養(yǎng)到成蟲,保持蟲體對(duì)農(nóng)藥藥性的高度敏感。選取大小一致、活動(dòng)力強(qiáng)的三齡幼蟲作為實(shí)驗(yàn)試蟲,置于洗凈干燥的飼養(yǎng)盒中,調(diào)節(jié)室溫在25℃,相對(duì)濕度75%~80%,光照周期L∶D=12 h∶12 h。
主要儀器:賽力多斯型精密分析天平(廣州深華實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備公司),JYW+200型表面張力儀(上海庚庚設(shè)備有限公司),TTGM型真空抽濾機(jī)(北京京輝凱業(yè)科技有限公司)。
原藥:10億PIB/g核型甜菜夜蛾多角體病毒干粉(seNPV,廣州市生物防治站自制),97%甲維鹽原藥(江蘇宏泰生物科技有限公司);助劑:有機(jī)硅(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化工院實(shí)驗(yàn)室自制),十二烷基硫酸鈉(阿拉丁試劑公司),對(duì)苯乙烯磺酸鈉(阿拉丁試劑公司),黃原膠(麥克林試劑公司),硅酸鎂鋁(麥克林試劑公司);溶劑:丙酮(天津大茂),蒸餾水(自制)。
1.2.1 seNPV、甲維鹽對(duì)甜菜夜蛾幼蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用人工飼料染藥法[11],對(duì)供試的兩種藥劑配置4個(gè)梯度濃度,seNPV濃度為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107PIB/mL,甲維鹽濃度為 1.52、1.74、2.25、3.21 mg/L,其中seNPV用蒸餾水配制,甲維鹽用丙酮溶解后用蒸餾水稀釋,另用蒸餾水作對(duì)照。將藥液用毛筆均勻的刷在切取好的飼料塊表面,每隔24 h檢查一次試蟲死亡情況,記錄死亡蟲頭數(shù),計(jì)算死亡率和校正死亡率[12]。每個(gè)處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)10頭蟲。利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)算毒力回歸方程和致死中濃度LC50。
1.2.2 seNPV·甲維鹽復(fù)配對(duì)甜菜夜蛾幼蟲的聯(lián)合作用 采用共毒因子法[13]對(duì)兩者的配伍合理性進(jìn)行測(cè)試。甲維鹽用少許丙酮溶解后用清水配制成濃度為致死中濃度LC50的藥液,seNPV用清水同樣配制到濃度為L(zhǎng)C50時(shí)的濃度,兩種藥劑按體積比不同配成一系列梯度的混劑(因seNPV起效慢,為避免甲維鹽藥性過強(qiáng)使試蟲過早死亡,故將甲維鹽作為輔助藥物使用)。用配制好的混劑對(duì)甜菜夜蛾幼蟲進(jìn)行毒力測(cè)定,處理的方法與上述單劑的處理方法相同。當(dāng)共毒因子≥+20時(shí),表示具有增效作用;≥-20時(shí)表示具有拮抗作用[14]。
1.2.3 共毒系數(shù)法篩選seNPV·甲維鹽最佳配比 在共毒因子法初步篩選出的配比增效區(qū)間內(nèi)設(shè)置7個(gè)不同濃度梯度的混劑藥液進(jìn)行毒力測(cè)定,采用共毒系數(shù)法[15]求出共毒系數(shù)值。若共毒系數(shù)≥120,為增效作用;若120>共毒系數(shù)>80,為相加作用;若共毒系數(shù)≤80,為拮抗作用[16]。
1.2.4 水懸浮劑的制備 在確定了農(nóng)藥有效成分seNPV和甲維鹽的最佳配比后,選用丙酮作為溶劑,采用溶劑替換法[17]制備seNPV·甲維鹽水懸浮劑,在常溫下將兩種原藥攪拌溶解于丙酮中,制成的有機(jī)相溶液慢慢滴加進(jìn)分散劑溶液中,通過減壓蒸發(fā),除去丙酮就可以得到復(fù)配農(nóng)藥水懸浮劑溶液。利用優(yōu)化組合實(shí)驗(yàn),確定各助劑的最佳用量和配比,制備均一穩(wěn)定的水懸浮體系。
1.2.5 水懸浮劑制劑的性能表征 參照GB/T14825-2006測(cè)定各組成分懸浮率,參照GB/T19136-2003測(cè)定熱儲(chǔ)穩(wěn)定性,參照GB/T19137-2003測(cè)定冷儲(chǔ)穩(wěn)定性,并測(cè)試葉片持留量和表面張力[18-19]。
從毒力回歸方程的角度進(jìn)行比較,根據(jù)回歸方程的大小與病菌對(duì)藥劑的敏感性成正比,斜率越大則說明蟲體對(duì)藥劑的敏感度越高。從表1可以看出,甲維鹽對(duì)甜菜夜蛾毒力回歸方程斜率為5.5898,明顯大于seNPV,說明甜菜夜蛾幼蟲對(duì)甲維鹽的敏感度更高,這可能是因?yàn)閟eNPV作為一種生物病毒農(nóng)藥,起效較甲維鹽慢的緣故。
表1 兩種單劑對(duì)三齡甜菜夜蛾幼蟲的毒力測(cè)定
測(cè)定了seNPV、甲維鹽不同配比混合對(duì)甜菜夜蛾幼蟲的毒力,根據(jù)共毒因子法顯示增效情況(表2),可得知seNPV和甲維鹽復(fù)配組合的增效區(qū)間在80∶1~350∶1 之間,在這個(gè)區(qū)間內(nèi)共毒因子均>20。
表2 共毒因子配伍結(jié)果
在增效區(qū)間80∶1~350∶1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明seNPV+甲維鹽組合在各自LC50濃度下體積配比為80∶1、100∶1、120∶1、150∶1、200∶1、250∶1、350∶1的情況下對(duì)甜菜夜蛾三齡幼蟲均有不同程度的增效作用,其中在體積配比為200∶1的情況下增效作用最為顯著,共毒系數(shù)為189.6544,增效倍數(shù)為0.9841。因此選用此配比為最佳配比,將LC50濃度的seNPV與甲維鹽按體積比100∶1(質(zhì)量比為1.88∶1.92)復(fù)配制成水懸浮劑。
由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和對(duì)市場(chǎng)上已有同類產(chǎn)品的對(duì)比選擇,本實(shí)驗(yàn)選用有效成分為seNPV與甲維鹽復(fù)配質(zhì)量比為1.96∶1,原藥含量在10%時(shí)進(jìn)行水懸浮劑的研制。
2.4.1 分散劑的篩選 水懸浮劑的粒徑很小,粒子之間容易發(fā)生團(tuán)聚,而分散劑可以有效降低粒子間的表面能,有利于體系的穩(wěn)定。選用3種水懸浮劑分散劑:十二烷基硫酸鈉(A1)、對(duì)苯乙烯磺酸鈉(A2)、有機(jī)硅(A3)進(jìn)行選擇試驗(yàn),測(cè)定葉片持流量、表面張力和懸浮率,結(jié)果見表4。從表4可以看出,3種分散劑單獨(dú)作用時(shí),A1的分散效果最好,懸浮率可以達(dá)到89%,但藥液的表面張力較高使得葉片持留量低,為24 mg/cm2;A3的分散效果雖然不及A1,但在3種分散劑中能最大限度降低藥液表面能,葉片持留量為33.62 mg/cm2;A1的分散效果和葉片持留量在3種分散劑中都不突出,可能是因?yàn)閷?duì)苯乙烯磺酸鈉陽離子表面活性劑對(duì)Ph敏感以及容易引起絮凝團(tuán)聚。
為了達(dá)到最好的分散效果,提高葉片持留量以增加藥液利用率,對(duì)3種分散劑混用進(jìn)行配比篩選,表4結(jié)果顯示A1∶A2∶A3=3∶1∶2時(shí),懸浮率達(dá)到89%,表面張力為26.02 N/m,葉片持留量達(dá)到29.65 mg/cm2,在各組配比中綜合效果最好,因此選取此配比為分散劑配比。
表3 最佳配比篩選結(jié)果
表4 分散劑的配比篩選
2.4.2 水分散劑含量的選擇 分散劑A1∶A2∶A3=3∶1∶2按5%、10%、12%、15%、20%的比例加入原藥中,攪拌均勻后測(cè)定懸浮率,進(jìn)行冷儲(chǔ)熱儲(chǔ)外觀觀察。從表5可以看出,分散劑含量越高,懸浮劑的懸浮率越高,在水分散劑含量超過12%以后,懸浮率隨含量變化的趨勢(shì)減緩;葉片持流量在水分散劑含量增加時(shí)變化不明顯,從成本角度出發(fā)選擇水分散劑的含量在12%更為合適。
從表6可以看出,當(dāng)分散劑含量上升時(shí),常溫和冷儲(chǔ)情況下制劑穩(wěn)定性也隨之提高;而熱儲(chǔ)情況下制劑的穩(wěn)定性都不如常溫和冷儲(chǔ),原因可能是甜菜夜蛾多角體病毒在高溫條件下失活,結(jié)構(gòu)改變引起沉淀。當(dāng)分散劑含量在10%時(shí),常溫下穩(wěn)定性已經(jīng)符合使用要求,結(jié)合對(duì)制劑懸浮率的測(cè)定結(jié)果,最終選擇水分散劑含量在12%時(shí)最合適。
2.4.3 抗沉降劑的篩選 因?yàn)椴《玖捷^大,靜置易產(chǎn)生沉淀,分層,影響使用,需要加入抗沉降劑進(jìn)行改善。取抗沉降劑含量為1.5%,對(duì)市面上常用的兩種抗沉降劑硅酸鎂鋁(B1)、黃原膠(B2)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見表7。從表7可以看出,單獨(dú)使用黃原膠,懸浮劑的析水率高,為30%;單獨(dú)使用硅酸鎂鋁時(shí)傾倒性較好,但析水率仍達(dá)到20%。這兩種抗沉降劑單獨(dú)使用時(shí)都不能得到很好的效果,對(duì)兩種抗沉降劑進(jìn)行聯(lián)用,當(dāng)硅酸鎂鋁與黃原膠的比例為1.0%:0.5%時(shí),懸浮劑的儲(chǔ)放析水率為5%,傾倒性良好,所以本試驗(yàn)以黃原膠與硅酸鎂鋁(1.0%+0.5%)復(fù)配作為抗沉降劑。
表5 水分散劑含量篩選
表6 冷、熱儲(chǔ)穩(wěn)定性試驗(yàn)
表7 抗沉降劑的篩選
室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明,seNPV與甲維鹽復(fù)配對(duì)甜菜夜蛾三齡幼蟲具有毒殺作用,毒力強(qiáng)度介于兩種農(nóng)藥單劑的毒力之間,因此可選用生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥的增效復(fù)配比用于甜菜夜蛾的防治,并初步確定了seNPV與甲維鹽的體積比在80∶1~350∶1時(shí)為增效區(qū)間。在此增效區(qū)間內(nèi)設(shè)置7個(gè)配比,采用共毒系數(shù)法進(jìn)一步篩選出兩種原藥的最佳配比,試驗(yàn)結(jié)果表明在體積配比為200∶1的情況下增效作用最為顯著,共毒系數(shù)為189.6544,增效倍數(shù)為0.9841。共毒因子法和共毒系數(shù)法的聯(lián)用提高了實(shí)驗(yàn)效率。試驗(yàn)結(jié)果還表明,表面活性劑的種類、比例和用量都是影響制劑體系分散性的重要因素,抗沉降劑的種類和比例則決定了懸浮劑的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。為降低溶液表面能使制劑具備良好的懸浮率和葉片持留量,實(shí)驗(yàn)測(cè)試了離子型表面活性劑十二烷基硫酸鈉、對(duì)苯乙烯磺酸鈉、有機(jī)硅作為水分散劑對(duì)懸浮率的影響,并通過正交試驗(yàn)對(duì)三種助劑的配比進(jìn)行了探索得出十二烷基硫酸鈉、對(duì)苯乙烯磺酸鈉、有機(jī)硅質(zhì)量比為3∶1∶2時(shí)水劑性能最佳,其中懸浮率為89.8%,葉片持留量為29.65 mg/cm2,表面張力為26.02 N/m。為提高制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性,加入黃原膠和硅酸鎂鋁作為穩(wěn)定劑,冷熱儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明這兩種助劑的加入明顯改善了制劑穩(wěn)定性,在兩者質(zhì)量比為1∶0.5時(shí)常溫儲(chǔ)放析水率僅為5%,符合使用要求。通過一系列的實(shí)驗(yàn),最終確定seNPV與甲維鹽復(fù)配農(nóng)藥水懸浮劑初步配方為:seNPV6.62%、甲維鹽3.38%、十二烷基硫酸鈉6%、對(duì)苯乙烯磺酸鈉2%、有機(jī)硅4%、硅酸鎂鋁1%、黃原膠0.5%,水76.5%。
本實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)環(huán)境下對(duì)復(fù)配藥劑進(jìn)行毒力測(cè)定并取得了良好的效果,但田間防治效果如何尚需進(jìn)一步試驗(yàn),復(fù)配藥劑的田間使用方法、適期、劑量等防治技術(shù)等還需進(jìn)一步研究,與農(nóng)業(yè)防治等其他防治措施的配合及其使用還有待進(jìn)一步探索。